如何使用DNase I减少单细胞悬液中的细胞团块

实验材料

• DNase I溶液（1 mg/mL，产品号 #07900）
• 培养基溶液或不含EDTA的缓冲液（如改良版HBSS (不含Ca++和Mg++) ，产品号 #37250）
• 胎牛血清（FBS）
• 两个50 mL锥形管（如Falcon®锥形管，50 mL，产品号 #38010）
• 细胞过滤器（如70 μm倒置过滤器，大号，产品号 #27260)
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• 含2% FBS的PBS（如含2%胎牛血清的Dulbecco's磷酸盐溶液，产品号 #07905）
• 移液器（如Corning® Lambda™ Plus移液器，产品号 #38060）
• 移液器枪头（如Corning®滤芯移液器枪头，产品号 #38034）
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实验流程

1. 在37°C水浴锅中快速旋转冻存管以解冻细胞。将解冻的细胞转移至灭菌的50 mL锥形管中。
   
   可选：先使用移液器在锥形管中加入0.25到0.5 mL DNase I溶液，再将解冻的细胞转移至管中。
2. 缓慢逐滴加入10 - 15 mL的含10% FBS的培养基或缓冲液，同时轻轻转动试管。
3. 用1 mL含10% FBS的培养基或缓冲液（例如PBS或者HBSS）冲洗冻存管，以收集管中残留的细胞，然后将培养基或缓冲液转移到新的试管中。
4. 用含10% FBS的培养基或缓冲液补满50 mL试管。轻轻涡旋混匀。
5. 室温下（15 - 25°C），300 x g，离心10分钟后收集细胞。
6. 小心地弃去尽可能多的上清液，尽量不要搅动细胞沉淀。轻轻敲打管壁来重新悬浮沉淀。
7. 如果细胞看上去成团块状，计算需要加入样本的DNase I达到终浓度为100 μg/mL所需的体积，逐滴加入DNase I并同时轻轻转动试管混匀。在室温下孵育15分钟。
8. 加入25 mL含2% FBS的培养基或缓冲液清洗细胞。轻轻倒置试管混匀然后离心（室温下，300 x g，10分钟）。弃去尽可能多的上清液，然后重新温和地重悬沉淀。
9. 如果细胞看上去仍然成团块状，使用一个37 - 70 µm的细胞滤网过滤样本并移入新的锥形管中。使用含2% FBS的培养基或缓冲液洗涤试管，然后使用细胞滤网过滤，重复三次。
10. 得到的单细胞悬液可以立即进行细胞计数和进一步的下游应用，例如细胞分选。