EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
使用流式细胞术进行交叉配型（FCMX）检测的细胞分选解决方案
使用流式细胞术进行交叉配型（FCMX）检测的细胞分选解决方案
- Document # 27033
- Version 2.1.0
- 1/31/22
案例研究：快速、优化的流式细胞术交 叉配型检测的开发和验证
为了减少周转时间并使FCXM（flow cytometry cross match,流式细胞术交叉配型）检测标准化，罗伯特·利斯基（Robert Liwski）博士开发了Halifaster流程。本篇技术公告讨论了这种快速、优化的FCXM检测流程是如何通过使用更快的细胞分离技术来缩短检测总时间。
背景介绍
为了推动实体器官移植，流式细胞术交叉配型（FCXM）检测法被用作移 植前风险评估的一部分，以确定接受器官移植的患者是否具有抗供体的 特异性抗体（DSA = donor specific antibodies）1。FCXM检测法可分为两 部分：
- 淋巴细胞富集，然后进行链霉蛋白酶和DNA酶处理2
- 交叉配型分析，然后使用流式细胞仪检测抗体
进行FCXM检测非常耗时，并且流程中的各个步骤（包括供体淋巴细胞富 集步骤）在不同实验室之间的操作缺乏一致性，这种标准化欠缺可能会导 致检测结果不一致。来自哈利法克斯（Halifax）戴尔豪斯大学（Dalhousie University）的Robert Liwski博士开发、优化和验证了两种FCXM流程，即 Halifax和Halifaster FCXM流程3,4。经优化的参数包括细胞分选方法、检 测平台、细胞数量，血清量和孵育次数。在本技术公告中，我们重点介绍 这些流程所使用的不同细胞分选方法。
标准和Halifax FCXM流程都使用密度梯度离心从供体血液中富集淋巴细 胞，这是非常费力且费时的步骤。使用密度梯度离心获得的淋巴细胞纯度 在15-90%之间变化，具体取决于供体和样本的质量5。在Halifaster FCXM 流程中，使用EasySep™ Direct淋巴细胞富集技术从全血中直接分离得到 淋巴细胞，而无需密度梯度离心或红细胞裂解。这种淋巴细胞分离方法速 度快，且最终获得总淋巴细胞纯度可达到95.8±2.2％（未在CD45上进行 门控）。由于淋巴细胞纯度在不同的富集方法之间存在差异，因此Liwski 博士评估了供体淋巴细胞纯度对FCXM结果的影响4,6。
在这里，我们讨论以下内容：
- 淋巴细胞纯度及其对DSA和FCXM检测结果的影响。
- 比较使用三种不同流程的FCXM结果和检测所用的总时间。
时间就是金钱
医学博士罗伯特·利斯基认为FCXM 检测需要更快，更标准化的流程。
方法
分别使用标准、Halifax和Halifaster流程3,4进行FCXM分析检测。在标准和 Halifax流程中，使用密度梯度离心液Lympholyte®（每样品所需时间～45 分钟）通过密度梯度离心从全血中分离细胞。在Halifaster流程中，使用EasySep™ Direct人总淋巴细胞分离试剂盒（产品号 #19655）（每样品所 需时间～25分钟）按照产品说明书的步骤从全血中直接分离细胞。对不同 流程得到FCXM分析结果进行比较。
此外，还评估了淋巴细胞纯度对FCXM结果的影响6。简而言之，使用相应 的EasySep™ Direct分离试剂盒（产品号 #19655、#19666和#19669）分离 得到淋巴细胞（Ly）、中性粒细胞（Nu）和单核细胞（Mo）。通过等比例 （各1/3）混合Ly，Nu和Mo细胞制备成全白细胞（WL）制剂。分别使用 WL（低淋巴细胞纯度）和Ly（高淋巴细胞纯度）进行FCXM分析，并对结 果进行了比较。
结果
图1. 使用EasySep™ Direct人总淋巴细胞分离试剂盒（产品号#19655）在保持细胞产量的同时提高了淋巴细胞的纯度
使用（A）密度梯度离心液Lympholyte®（～45分钟/样品）或（B）EasySep™ Direct分离试剂盒（～25分钟/样品）从同一已故捐赠者的全血样本中分离细胞，并通过流 式细胞仪进行分析。使用EasySep™ Direct可以得到更加干净的样本。（C）与使用 Lympholyte®分离的样本相比，使用EasySep™ Direct分离试剂盒得到的样本所含 的污染细胞更少，并且T（CD3 +）和B（CD19 +）细胞的总数保持不变。每个带有误 差线的柱代表来自24 mL全血的平均值±SD（n = 20个供体）。数据由罗伯特·利斯 基博士提供。
图2. 与全白细胞样本相比，使用EasySep™ Direct分离试剂盒得到的高 度富集的淋巴细胞可有助于DSA检测
使用EasySep™ Direct分离试剂盒#19655、#19666和#19669分别从志愿者供体 （n = 5）中分离出淋巴细胞（Ly）、中性粒细胞（Nu）和单核细胞（Mo）。等比例混 合Ly、Nu和Mo细胞以得到全白细胞（WL）。以链霉蛋白酶处理WL（低淋巴细胞纯 度）和Ly（高淋巴细胞纯度）细胞制剂，然后针对阴性对照血清或几种经稀释的阳 性对照血清进行FCXM分析。以阴性对照血清样本为基线得到中位数通道荧光位 移（median channel fluorescence shifts, MCFS），然后比较WL和Ly之间的MCF位 移，每个带有误差线的柱代表平均值±SEM（n = 5个供体）。数据由罗伯特·利斯基 博士提供。
图3. 使用EasySep™ Direct分离试剂盒从全血中分离淋巴细胞不会降低 FCXM检测的灵敏度
对EasySep™ Direct（Halifaster流程）或密度梯度离心液Lympholyte®（标准和 Halifax流程）分离的细胞以平行实验进行B细胞FCXM检测。比较（A）标准流程和 Halifax流程和（B）Halifaster流程和Halifax流程的FCXM结果。中位数通道荧光位移 （MCFS）的线性回归分析显示，即便使用两种不同细胞分离方法，B细胞和T细胞（ 未在此显示）FCXM检测具有极好的相关性。数据以MCFS距离阳性判断值（cutoff） 的位移表示，阳性判断值（cutoff）定义为平均值+三个标准差。数据由罗伯特·利斯 基博士提供。
图4. 按照Halifaster FCXM流程将FCXM检测的总耗时降至2小时以内
FCXM检测的细胞制备部分包括淋巴细胞分离和链霉蛋白酶以及DNAse处 理。Halifaster FCXM流程将细胞制备所需的时间减少了近40%（从90分钟到55分钟） ，关键是使用了EasySep™ Direct分离技术对淋巴细胞进行分离。该技术比标准流程 和Halifax FCXM流程所使用的密度梯度离心方法明显快得多。使用标准、Halifax和 Halifaster进行FCXM检测所需大约总时间（包括细胞制备）为175分钟、125分钟和85 分钟。数据由罗伯特·利斯基博士提供。
EasySep™Direct细胞分离技术的应用对我们进行细胞分离和FCXM检测的准备时间带来了非常积极的影响。此外，我们发现淋巴细胞纯度的提升缩短了流式细胞术的时间，并且让设门和分析变得更加简单。
Liwski RS et al. (2018)
总结
- Halifaster流程使用了EasySep™ Direct试剂盒来分离淋巴细胞。与使用Lympholyte®的密度梯度离心法相比，前者得到污染的细胞更少。
- 使用EasySep™ Direct分离法得到的高度富集的淋巴细胞进行FCXM检测，有助于DSA的检测并可降低FCXM结果的差异性。
- Halifaster FCXM流程将进行FCXM检测的总时间缩短至2小时以内，而不会影响质量或灵敏度。部分原因是将淋巴细胞分离步骤缩短 30分钟以内。
流式细胞术交叉配型检测的细胞分离
EasySep™ Direct分离法可直接从全血中分离得到未经标记的高纯度细 胞，而无需进行密度梯度离心、沉淀或红细胞（RBC）裂解。高度纯化的 细胞可立即用于FCXM检测。EasySep™ Direct分离法操作温和、快速、 有效且高效，并且适用于较老的血液样本。来自0.5-30mL的单个样本 可在短短20分钟内手动操作完成。为提高样本通量并减少样本处理误 差，EasySep™ Direct细胞分离可通过RoboSep™仪器进行全自动化分选。
EasySep™ Direct的原理是什么？
EasySep™ Direct是一种强大的免疫磁珠技术，无需离心和RBC裂解即可分离出高度纯的细胞。细胞分离可以手动操作，也可以使用RoboSep™-S仪器自动进行。
1. 该试剂盒为CE认证，可在欧盟、加拿大、越南、马来西亚、泰国，和澳大利亚作为I级体 外诊断设备（IVD）使用。若想了解您所在地区的产品管制状态的更多信息，请联系 info@stemcell.cn或访问STEMCELL管制产品。
参考文献
- Rebibou JM et al. (2004) T-cell flow-cytometry crossmatch and longterm renal graft survival. Clin Transplant 18(5): 558–563.
- Vaidya S et al. (2001) Improved flow cytometric detection of HLA alloantibodies using pronase: potential implications in renal transplantation. Transplantation 71(3): 422–8.
- Liwski RS et al. (2015) Development and Validation of a Rapid Optimized Flow Cytometry Crossmatch (FCXM) Assay, the Halifax and Halifaster FCXM Protocols. ASHI Quarterly (Third Quarter 2015): 19–25.
- Liwski RS et al. (2018) Rapid optimized flow cytometric crossmatch (FCXM) assays: The Halifax and Halifaster protocols. Hum Immunol 79(1): 28–38.
- Hamrick C & Lebeck L. (2000) Flow cytometric T and B cell crossmatching. ASHI laboratory manual, 4th Ed. Philadelphia: American Society for Histocompatibility and Immunogenetics: 41–45.
- Liwski RS et al. (2016) P099 The impact of lymphocyte purity on flow cytometry crossmatch (FCXM) assay. It’s not purely theoretical. Hum Immunol 77, Supple: 110–111.
沪公网安备31010102008431号