EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
脑类器官的冷冻切片和荧光染色
脑类器官的冷冻切片和荧光染色
- Document # 27171
- Version 1.0.0
- 11/25/19
背景
脑类器官为中枢神经系统的研究提供了一种模拟人体生理环境的模型。
这类三维（3D）体外培养的类器官能够帮助研究正常和疾病状态下人脑
的发育过程，在诸如自闭症1，精神分裂症2或因病毒感染3导致的脑缺陷研
究中具有重要的应用。
使用人多能干细胞（hPSCs）建立脑类器官的主要优势在于重现发育中人
脑的3D结构。脑类器官中的中枢神经组织形成分层结构和伪脑室，与在
生物体内观察到的大脑结构相似。为了分析研究这种特殊的细胞结构，需
要专业的组织学方法。
在处理具有复杂结构的大型三维组织（如脑类器官）时，有着许多技
术上的技巧。除了实验上的小心操作，这些类器官还需要足够的穿透
（penetration），固定（fixation），抗冻保护（cryoprotection）来保持其组
织形态。这些实验流程可能会影响蛋白表面的抗原结构，使得抗体无法识
别抗原表位，继而影响实验结果。
下文的操作流程描述了对成熟的脑类器官进行冷冻切片和免疫荧光染色
时，降低对组织伤害与保留关键抗原表位的方法。样本制备的优劣会对
其后荧光染色结果造成很大影响，某些抗体与脱水固定的组织结合地更
好（表1）。表2和表3所列出的抗体适用于4％ PFA溶液固定的脑类器官组
织。
表1. 化学组织固定剂的优点和缺点
材料和试剂
所需材料
- 切片盒（如Millipore Sigma 产品号 #S5516）
- ImmEdge™ Hydrophobic Barrier PAP Pen (Vector 产品号 #H-4000)
- 50 mL离心管（）
- 低温恒温箱
- 载玻片和盖玻片
- 干冰
所需试剂
- 4%多聚甲醛溶液（4% Paraformaldehyde solution，4% PFA溶液）(Alfa Aesar 产品号 #J61899)
- 蔗糖
- D-PBS（不含Ca++与Mg++）（）
- Tween® 20（Sigma-Aldrich 产品号 #G2500-1KG）
- 叠氮化钠（NaN3）
- 100%乙醇
- Thermo Scientific™ Lab Vision™ PermaFluor™ Aqueous Mounting Medium（Fisher Scientific 产品号 #TA030FM）
- 牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）(Sigma-Aldrich 产品号 #A7906-100G)
- 驴血清（Normal Donkey Serum，NDS）(Millipore 产品号 S30-100ML)
表2. 验证过的一抗
查看STEMCELL提供的关于神经科学的抗体清单
表3. 验证过的二抗
Rt = 大鼠；Ms = 小鼠；Rb = 兔
制备试剂
30％蔗糖溶液
制备1 L的30％蔗糖溶液：
- 称取300克蔗糖。
- 加入D-PBS至1 L终体积。
- 混合均匀。
明胶溶液
制备100 mL明胶溶液：
- 将10 g蔗糖添加到100 mL D-PBS中。
- 将7.5 g明胶添加到步骤1中的蔗糖溶液中。
- 混合均匀。
PBS-T
制备1 L的0.1％ PBS-T：
- 将1 mL Tween® 20加入1 L D-PBS中。
- 混合均匀。
一级稀释缓冲液
制备100 mL一级稀释缓冲液：
- 将叠氮化钠添加到100 mL PBS-T中至终浓度为0.05％。
- 将BSA添加到100 mL叠氮化钠/ PBS-T溶液（步骤1制备）中至终浓度为5％。
- 混合均匀。
封闭液（Blocking Solution）
- 用PBS-T稀释驴血清至终浓度5％。
- 混合均匀。
操作流程
培养脑类器官
本操作流程使用STEMdiff™脑类器官试剂盒（产品号 #08570）培养 脑类器官。想要了解更多关于培养脑类器官的信息，请访问https://www.stemcell.com/GrowCO观看技术操作视频。
固定脑类器官
- 使用1 mL（p1000）移液枪头，将类器官转移到50 mL离心管中。
注意：可以剪掉枪头尖，以免损伤类器官。 - 吸出培养基。D-PBS清洗三次，每次10分钟。移除D-PBS。
- 加入4% PFA溶液。在2-8℃过夜孵育(16小时)。
注意：为了正确以及彻底地固定样本。我们推荐使用新鲜配制的4% PFA溶液。 - 吸出PFA。PBS-T清洗类器官三次，每次10分钟。
- 将类器官保存在2-8℃ PBS-T中（最长可保存一周）。
抗冻保护（Cryoprotection）
将类器官孵育在30%蔗糖溶液中（见“试剂制备”），防止在冻存不善带 来的冰晶破坏蛋白结构所形成的伪影。
- 吸出PBS-T，加入5 mL 30%蔗糖溶液。
- 2 - 8℃孵育过夜。
注意：类器官的孵育时间可以根据样本的大小和密度做出调整。 当类器官不再浮于溶液中，则可以停止孵育并进行下一步实验。
包埋（Embedding）
- 水浴中将明胶溶液温热至37℃。
- 移除离心管中的蔗糖溶液，加入明胶溶液至完全浸没类器官。
- 37℃孵育1个小时。使明胶可以渗透Corning® Matrigel® droplet 并完全覆盖类器官。（详情请见STEMdiff™脑类器官试剂盒产品 信息表）
- 取出类器官，转移到包埋模具中。
注意：明胶在室温下会开始聚合并硬化；必须快速将类器官转移 到包埋模具中。
速冻（Snap Freezing）
速冻有助于防止类器官中冰晶的形成，并有助于维持样本的天然细 胞结构。
- 将干冰加入100%乙醇中制备干冰/乙醇浆液。
- 混合液停止沸腾后，加入包埋的样本。
- 将样本置于冷冻浆液中直至完全冷冻，然后将样本转移至-80℃ 冰箱长期保存。
冷冻切片
- 从-80℃冰箱中取出冻块，在低温恒温箱中加热30分钟至切片所
需温度。
注意：明胶包埋类器官的最佳切片温度为-26℃至-30℃。 - 切片厚度可以根据后期选择的成像系统（imaging system）调
整。常用的厚度为10-20 μm。
注意：多个连续切片能在不同区域观察不同的标志物。
免疫荧光
- 从冰箱中取出切片载玻片，并使其在室温下干燥。
- 用PAP笔勾勒出切片轮廓。笔蜡完全干燥后，进行下一步。
- 如有必要，可进行抗原恢复，或直接进行步骤20。
（可选）抗原修复
PFA固定所形成的共价交联（Cross-linkages）可能会干扰或占据抗原 表位（reviewed by Shi et al. 1997）。4因此，在一抗结合前，有些样本 需要额外的抗原修复。
额外所需实验材料
- Food steamer（如Hamilton-Beach 37530）
- （耐高温塑料）切片盒
- 二水柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）2.94 g
制备柠檬酸盐缓冲液
准备1 L柠檬酸盐缓冲液
- 将2.94 g 二水柠檬酸钠添加到950 mL dH2O中。
- 用HCl/NaOH调节pH值至6.0。
- 加入0.5 mL的Tween® 20。
- 加dH2O至1 L。
抗原修复操作流程
- 将载玻片放入切片盒，加满柠檬酸缓冲液。
- 将放有切片的切片盒放入Food steamer中加热20分钟。
- 小心移除热柠檬酸缓冲液，用PBS-T清洗载玻片3次，每次 10分钟。
封闭
- PBS-T清洗载玻片10分钟，清除明胶。
- 将载玻片平放，并滴上足够的封闭缓冲液。笔蜡的轮廓会将封闭 缓冲液保持在组织切片上。
- 室温下于加湿箱中孵育1小时。
一抗
- 制备一抗稀释液。推荐的稀释比例参照表2。
- 倒掉封闭缓冲液，替换为一抗稀释液。
- 室温下于加湿箱中过夜孵育（16小时）。
二抗
- 在PBS-T中准备二抗稀释液。推荐的稀释比例参照表3。
注意：Alexa Fluor®抗体非常稳定，但也应注意不要将抗体长时 间暴露在直射光下。 - 倒掉一抗稀释液，将载玻片放入切片盒中，PBS-T清洗载玻片三 次。
- 将载玻片平放，并滴上足够的二抗稀释液，室温下于加湿箱中孵 育2小时。
盖玻片
- 倒掉二抗稀释液，将载玻片放入切片盒中。
- PBS清洗载玻片三次，每次30分钟。
- 晾干5分钟。
- 在载玻片上滴上PermaFluor™，盖上盖玻片。在镜下观察前保存 在2-8℃中。
预期结果
使用培养的类器官可观察到皮层发育的神经元分层现象，包括在脑室边缘处活跃增殖的细胞，中间祖细胞的扩增，以及 顶端祖细胞区域皮质板样神经元。
下图是使用上述操作流程处理的第40天脑类器官切片的荧光图像，切片厚度为16 μm，放大倍数为20倍。
图1.
对类器官组织进行免疫荧光染色，CTIP2（绿色），PAX6（品红色），III类β-微管蛋白/ TUJ1（蓝色）和DAPI（灰色）。伪脑室（pseudo-ventricle，虚线部分）周围放射状分布 PAX6+神经祖细胞，此为皮层区，这些神经祖细胞可进一步分化为皮质板神经元（ 表达CTIP2和TUJ1）。 比例尺= 500 μm。
图2
对类器官组织进行免疫荧光染色，TBR2（中间前体，绿色）和磷酸化 vimentin（PVIM，分裂中的细胞，品红色）。细胞在伪脑室（pseudo-ventricle，虚线 部分）周围的皮质区边界处活跃分裂，一部分分裂细胞表达TBR2，并向祖细胞区向 中央（箭头）迁移以形成中间祖细胞（intermediate progenitors）。 比例尺= 100 μm。
图3
对类器官组织进行免疫荧光染色，CTIP2（绿色），TBR1（5/6 皮层神经元，品红色） 和DAPI（白色）。假定祖细胞区域（presumptive progenitor zones）（白色）内部中 心处的细胞以及类器官外表面的细胞表达深层神经元标志物（CTIP2和TBR1）。 比例尺= 100 μm。
图4
对类器官组织进行免疫荧光染色，FOXG1（前脑细胞，绿色）或SOX2（神经祖细 胞，品红色）。由STEMdiff™脑类器官试剂盒所培养脑类器官能够生成前脑型组织 （forebrain-type tissue，表达FOXG1）。SOX2神经祖细胞在假性脑室区域（虚线） 周围呈放射状排列。 比例尺= 100 μm。
讨论
中枢神经系统结构复杂，需要灵敏的组织学技术，才能在显微镜观察下真实重现这种结构。本操作流程帮助使用者在对组织结构损坏最小的情况下，对三 维培养的类器官进行冰冻切片。三维脑类器官切片在显微镜下的照片可以呈现出在二维（2D）图像下无法观察到的表型结构。例如，使用常规二维培养无 法观察皮质分层中的缺陷。
从干细胞分化培养神经类器官的技术已成为科学家研究人类神经组织及其结构的重要手段，这些技术使科学家能够对神经系统功能性的研究提出新的问 题和假设。皮质分层缺陷与精神疾病如精神分裂症2,5有关。另外，在Rett Syndrome的小鼠模型中6，V层神经元中的树突棘密度受到很大影响。从患者处取 得的细胞样本，衍生为相应的类器官并对其进行研究的手段，可以更快更有效地为患者设计治疗方案，应用于临床研究。
参考文献
- Forsberg S et al. (2018) Epigenetics and cerebral organoids: promising directions in autism spectrum disorders. Transl Psychiatry 8(1): 14.
- Stachowiak E et al. (2017) Cerebral organoids reveal early cortical maldevelopment in schizophrenia-computational anatomy and genomics, role of FGFR1. Transl Psychiatry 7(11): 6.
- Lancaster M et al. (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501(7467): 373–9.
- Shi S et al. (1997) Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J Histochem Cytochem 45(3): 327–43.
- Garey L et al. (2010) When cortical development goes wrong: schizophrenia as a neurodevelopmental disease of microcircuits. J Anat 217(4): 324–33.
- Stearns N et al. (2007) Behavioral and anatomical abnormalities in Mecp2 mutant mice: a model for Rett syndrome. Neuroscience 146(3): 907–21.
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