人原代支气管上皮细胞（HBECs）可以浸没在(产品号# 05008) 或者（产品号# 05040）培养基中进行扩增，并在（产品号 #05001）通过气液界面分化为具有生理相关性的粘膜纤毛表型。PneumaCult™为成分确定、无血清、无牛垂体提取物（BPE）的培养体系。下文阐述了HBECs在PneumaCult™中扩增和分化时的关键步骤。

放入培养皿前在PneumaCult™-Ex中浸润培养细胞：

• 使用活率高的，低传代次数的HBEC细胞。传代不超过3次的细胞适用于气液界面培养（ALI培养）。请注意细胞分化至纤毛和可产生粘液的细胞的潜能可能早在第4代就开始降低。
• 浸润培养的细胞达到大约80%融合度时，可进行传代。

放入培养皿前在PneumaCult™-Ex Plus中浸润培养细胞：

• 使用活率高的，低到中等传代次数的HBEC细胞。与其他商业化扩增培养基相比，在PneumaCult™-Ex Plus中细胞多传代两次也适用于气液界面培养（ALI培养）。与PneumaCult™-Ex或BEGM™培养基相比，在PneumaCult™-Ex Plus中培养的HBECs具有至少多两次以上的细胞分裂扩增 （population doublings）。
• 浸润式培养的细胞达到大约50-70%融合度时，可进行传代。

使用Transwell®培养皿浸润培养细胞：

• 将细胞传代于Transwell®时，应避免使用血清。我们推荐使用预热的胰蛋白酶-EDTA（产品号 #07910）来收集细胞，并使用预热的大豆胰蛋白酶抑制剂（例如Sigma的产品#T6522）来终止胰蛋白酶消化。如使用PneumaCult™-Ex Plus培养基，可使用我们的无动物源细胞解离试剂（产品号 #05426）。

细胞在Transwell®和PneumaCult™-ALI中浸润扩增阶段：

• 在Transwell®中将HBECs铺板后，使其在PneumaCult™-Ex或PneumaCult™-Ex Plus中扩增至80%融合度。通常情况下，培养2-4天即可达到，但是有些来源的细胞可能需要更长时间。我们不推荐在细胞低于80%融合度时转换为气液界面培养。
• 每两天更换上、下小室中的PneumaCult™-Ex或者PneumaCult™-Ex Plus培养基。

细胞在Transwell®和PneumaCult™-ALI中气液界面方式的维持培养阶段：

• 只在下层小室中加入PneumaCult™-ALI培养基。每两天更换一次培养基。
• 如需避免周末换液，可在周五下午更换培养基，然后在周一早上再次更换。
• 气液界面培养两周后，细胞开始分泌粘液。过多的粘液可以使用500µL预热的无钙镁离子PBS温和洗涤细胞来去除。此步骤可每周重复一次。
• 如粘液过于粘稠，可加入500µL预热的无钙镁离子PBS，37°C孵育30分钟后用移液枪或真空泵吸除。如粘液积聚较多，可重复上述洗涤步骤。

如需更多在、、和中培养HBECs的信息， 请参见相关的产品说明书（产品页面的技术资料栏中）。

如需更多信息或帮助，请联系techsupport.cn@stemcell.com。