小鼠肠道类器官可使用 （产品号#06005）进行构建并维持长期培养。下文中列出了确保成功分离小鼠肠道隐窝和培养小鼠肠道类器官的关键步骤。

常规提示：

• 在整个过程中，在操作肠段或者隐窝之前，应预先将移液管和移液头湿润，从而预防组织粘连到移液管壁上。
• 为对细胞的破坏降至最低并确保最大限度地回收细胞，在室温条件下使用培养基和 （GCDR），但用于清洁和洗涤过程的PBS和DMEM/F12则需保持冰冷。
• 有关采用IntestiCult™培养肠道类器官的概要请观看本。

分离小鼠肠道隐窝：

• 在处理肠道的过程中，应先清除肠系膜（连接肠道与腹壁的膜），然后才切割小肠。如果肠系膜未预先去除，在随后的洗涤步骤中肠段则难以沉降。
• 将肠道切割为2mm的小段之后，为确保肠段干净，需要在PBS中冲洗15至20次。如果冲洗次数少于15次，则皱襞部分可能会残留一些有毒物质，对类器官的生长产生不利影响。
• 在冲洗过程中需通过重力实现肠段的沉降。若使用离心分离可能会导致其他杂质沉淀，而导致隐窝收获率降低。

将肠道隐窝铺板生成类器官：

• 隐窝经分离后进行铺板时，必须使用预热处理的培养板和水冷的Matrigel®，这样才可确保隐窝悬浮。如果隐窝接触并粘在孔的表面上，将会出现分化现象。
• 含有肠道隐窝的Matrigel®滴液凝固之后，沿孔壁一侧向孔中添加IntestiCult™培养基。如果培养基直接加入到Matrigel®的液滴上，液体的作用力会破坏圆顶状的Matrigel®液滴。
• IntestiCult™培养基应完全覆盖圆顶状的Matrigel®液滴。
• 非常重要的是，隐窝应使用三种不同密度进行铺板。培养基和类器官本身均能够产生促使类器官扩增和成活所需的因子。如果隐窝的接种密度过大，则隐窝无法从培养基中吸收充足的营养，实现适当扩增。如果隐窝的接种密度太小，则类器官无法产生充足的因子，从而也会导致无法实现适当扩增。

传代肠道类器官培养物：

• 类器官开始萌芽时，应对类器官进行传代。当细胞死亡时，它们进入管腔，使之变得阴暗。。建议在显微镜下观察，确保在类器官培养物管腔变暗之前对其进行传代。
• 在传代过程中，解离类器官有两个要素：在GCDR中进行孵育时间以及使用移液管手动搅拌的力度。如果在GCDR中对类器官的孵育时间过长或者搅拌过度，则可能会出现过多的单细胞，应避免这种情况。

有关肠道隐窝分离、肠类器官培养和常见问题的更多详细信息，请参见.

如需帮助和更多信息，请发送邮件至techsupport@stemcell.com