癌症是全球主要的死亡原因之一，而大肠癌是最常见的癌症类型之一。尽 管肿瘤细胞系和动物模型已经揭示了许多有关肠道癌的信息，但从癌症 样本来源的肠道类器官可以更真实地重现起源肿瘤的组织结构、细胞异 质性和形态¹1 。因此，癌症来源的类器官被证明可以可以用于研究癌症生 物学的有用实验模型，包括疾病进展以及受影响的信号通路和肿瘤微环 境²。癌症样本来源的类器官还可以实现更多的转化医学应用，例如激活 和扩增肿瘤反应性T细胞群体，预测患者特定的治疗结果，并筛选潜在的 治疗药物^3,4

在本技术操作手册，我们描述了如何使用（IntestiCult™ OGM Human Basal Medium，旧名 IntestiCult™ OGMH组分A；产品号 #100-0190）培养Wnt-independent （不依赖于Wnt）的癌症样本来源的肠类器官。查阅完整实验流程，请配 合IntestiCult™产品说明书（PIS；文档号 #DX21423）一起使用，包括如何 从人的活检样本中分离出结肠隐窝（colonic crypts），从分离的肠隐窝建 立肠类器官的培养体系，以及如何通过传代对肠类器官的培养体系进行 扩增和维持培养。

操作流程

下述操作流程与Hubrecht Organoid Technology合作开发，用于在 IntestiCult™ OGMH培养Wnt-independent结肠癌样本来源的肠类器官。 本操作流程不适用于没有携带Wnt信号通路活化突变的肿瘤。

A. 培养基制备

以下为制备100 mL IntestiCult™ OGMH用于培养Wnt-independent癌症 样本来源的类器官（IntestiCult™ OGMH组分A + DMEM/F-12 with 15 mM HEPES；若仅购买IntestiCult™ OGMH组分A，请联系我们的客服部 门）。如需配置其他体积，请进行相应调整。

1. 于室温（15 - 25℃）解冻IntestiCult™ OGMH组分A或过夜2 - 8℃解 冻。混合均匀。立即使用或分装后于-20℃保存最多3个月。分装后的 培养基重新解冻后，需马上使用。切忌反复冻融。
2. 混合50 mL IntestiCult™ OGMH组分A和50 mL DMEM/F-12 with 15 mM HEPES。混合均匀。如果不立即使用，可于2 - 8℃储存最多 一周。
3. 使用前加入所需的抗生素（例如，50 μg/mL庆大霉素）。

B. 从肿瘤活检样本中分离组织

1. 冰上解冻100 μL Matrigel®。
   注意：这足够4个培养domes（液滴）的用量。
2. 将下列试剂置于冰上：D-PBS（不含Ca++和Mg++），DMEM + 1% BSA（配置方法查阅PIS[文档号 #DX21423]）
3. 将经组织培养处理的（tissue culture-treated）24孔板在37℃培养箱 预热至少2小时。
4. 在15 mL离心管中，使用10 mL冰冷的PBS清洗组织样本。通过重力 沉降组织（约5秒），吸除上清液。
5. 重复第4步，管中保留1 mL上清液。
6. 使用1 mL枪头将组织和剩余的上清液转移至一个1.5 mL EP管中。
7. 使用无菌剪刀，将组织切碎成约5mm的小块。使用1 mL枪头将组织 小块转移至新的15 mL离心管中。用PBS清洗EP管，一并转移至离心 管中。
8. 重力沉降组织小块（约5秒），吸除上清液。
9. 加入10 mL温和细胞解离试剂。在中速（约40 rpm）的水平摇床上以 37℃孵育60分钟。
10. 以290 x g，离心5分钟。吸除上清液。
    注意：接下来的所有步骤，枪头需使用DMEM + 1% BSA预先湿润， 才可操作样本。这可避免隐窝黏附在枪头壁上造成样本流失。
11. 加入1 mL冰冷的DMEM + 1% BSA。使用1 mL枪头剧烈上下吹打 20次。
    注意：避免枪头接触到管底。
12. 使用一个1 mL的枪头，将管中的样品通过70 μm细胞筛网转移至一 个新的15 mL离心管中。并使用1 mL DMEM + 1% BSA润洗细胞 筛网。

C. 从分离的活检组织中进行类器官培养

有关如何将分离的组织接种成为类器官培养物的完整说明，请查阅PIS （文档号 #DX21423）的B部分，第2步。当使用从癌症组织来源的样 本时，使用本操作步骤A部分中配置的培养基，而不是完全培养基 IntestiCult™ OGMH。

生长培养基需每两天更换一次，培养体系每隔6 - 12天传代一次。有关传 代流程的完整说明，请参阅PIS（文档号 #DX21423）。当使用从癌症组织 来源的样本时，使用本操作步骤A部分中配置的培养基，而不是完全培养 基IntestiCult™ OGMH。

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