EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
从少量脐带血样本中去除红细胞
从少量脐带血样本中去除红细胞
- Document # DX20368
- Version 1.0.1
- 12/1/20
引言
脐带血样本中存在大量的红细胞（RBCs）会减少造血干和祖细胞（HSPCs）检测的准确性。比如包括集落单元检测（CFU），流式细胞术分析CD34或者乙醛脱氢酶（ALDH）的活性等一些检测。这些分析通常被脐带血库用于在建库之前评估脐带血的质量，以作为冷冻保存方案质量控制的一部分，或用于帮助选择用于移植的脐带血。因此，降低HSPC检测的差异性对脐血库至关重要。
常用的去除RBCs的方法包括沉淀法和氯化铵裂解法。这些技术通常包括长时间的孵育或离心步骤，可能无法很好地处理冻存样本，或者很难处理小体积样本，例如黏附在脐带血袋的部分。
作为整套CFU分析标准化工具的一部分，STEMCELL Technologies开发了ErythroClear™ 红细胞去除试剂盒（产品号 #01739）。该试剂盒能在2分钟内一次性从16个小体积（50-100μL）脐带血样本中去除红细胞。ErythroClear™试剂含有免疫磁珠，能与糖蛋白AB+（GlyAB+）细胞结合，然后用ErythroClear™磁极选择性地去除红细胞。
图1. 使用ErythroClear™去除红细胞后脐带血CFU检测集落图像
铺板之前使用ErythroClear™（A） 去除RBC和（B）没有去除RBC的脐带血CFU检测的STEMvision™成像图。从放大的橙色圆圈区域可以看出没有RBC背景干扰的MethoCult™培养基中更容易识别小的或扩散的集落。
为何使用ErythroClear™？
- 仅需2分钟即可一次性处理多达16个样本。
- 适用于新鲜或冻存脐带血。
- 优化用于小体积样本（50 - 100 μL）
- 去除99%的GlyAB+ RBCs，而不改变祖细胞的比例。
图2. ErythroClear™不会改变脐带血样本中CFUs的比例
在Erythroclear™去除（Y轴）和没有去除（X轴）的脐带血样本中CFUs的比例。接种至MethoCult™ H4434 Classic培养基前使用ErythroClear™处理每个脐带血样本的一半。每个样本的另一半在没有去除RBC的情况下直接接种。培养14天后，手动记录去除和没有去除RBC的样本中CFUs的总数（n = 32个新鲜(▲) 和 8个冻存 (•)脐带血样本，实线 = 线性回归最佳拟合；圆点表示95%的置信区间）。使用ErythroClear™去除红细胞前后各样本CFUs比例无显著性差异，且在测试样本中具有高度相关性（相关系数R2=0.83）。使用ErythroClear™去除红细胞后，总的有核细胞（TNCs）的平均回收率为75%。
*Each kit is suitable for processing 2 mL of cord blood as 20 x 100 μL samples.
操作流程
- 将100μL新鲜或冷冻脐带血加入到一个空的1.5-2 mL试管。对每个样本重复上述步骤。
- 在每个有脐带血的试管中加入：
- 280 μL含有2%FBS的PBS（产品号 #07905）
- 170 μL ErythroClear™试剂
- 上下吹打，彻底混匀每个试管
- 室温下（15 - 25°C）孵育1分钟
- 将试管置于ErythroClear™磁极中，室温下（15 - 25°C）孵育1分钟。
- 从试管的远离磁极的一侧吸取RBC去除上清液。
注意：推荐使用P-1000枪头或更小的枪头吸取以去除RBC的上清液。 - 获得的细胞可立即用于计数和下游CFU检测或流式细胞分析。
图3. 使用ErythroClear™去除RBC后不会改变脐带血中CD34+细胞的比例
图示为GlyAB-CD45+细胞，即使用ErythroClear™去除RBC前（浅金色）后（金色）脐带血样本中的CD34+细胞的比例。每个样本中去除RBC前后CD34+细胞的比例没有显著差异（p>0.01）。使用ErythroClear™去除RBC后的CD34+细胞的回收率为70%。此外显示ALDH活性（ALDHbright）的GlyAB-CD45+（数据未显示）在ErythroClear™处理后无显著差异（p>0.01，数据未显示），且这些细胞的回收率为66%。（n = 8个冻存的完整脐带血样本，分成三份处理和分析；带有误差线的柱子表示平均值 ± 标准偏差）。
表1. ErythroClear™能快速、灵活地进行小体积脐带血样本中的RBC去除。
*基于完整脐带血中130 GlyAB+CD45-红细胞比1白细胞（WBC）的平均起始比例，以及使用ErythroClear™去除后的样本中0.25 RBC:1 WBC的平均最终比例。
沪公网安备31010102008431号