制备单细胞悬液对细胞分离是否成功至为关键。 使用含有细胞团块的样本进行细胞分离会导致细胞回收率降低，并且可能会影响正确的靶细胞标记。

当样本被反复冻融或者使用酶分解组织时，样本有时会呈现“团块状”。这是因为外界压力加速细胞死亡，从死细胞中释放出来的“粘性”DNA分子将邻近的细胞粘合在一起，因此产生了细胞团块。

在样本中加入脱氧核糖核酸内切酶 I（DNase I）可以减少DNA悬浮碎片和细胞团块。现今有许多使用DNase I以减少细胞团块的有效操作方法。我们推荐在细胞悬液中加入DNase I溶液（ ）至终浓度为0.1 mg/mL（或者200 Kunitz units/mL），并在室温孵育15分钟之后进行下游应用。

下面的复苏冷冻样本的方法描述了使用DNase I制备单细胞悬液和减少细胞团块的操作步骤：

1. 在37°C水浴中快速旋冻存管。将解冻的细胞转入一个灭菌过的50mL圆锥管。 可选择：在圆锥管中加入0.25到0.5 mL初浓度为1 mg/mL DNase I溶液，然后再将解冻的细胞 转入管中。
2. 用1 mL含10% FBS的培养基或缓冲液（例如PBS或者HBSS）冲洗冻存管，以收集管中残留的细胞，然后将培养基或缓冲液转移到新的试管中。
3. 缓慢逐滴加入10-15 mL的含10% FBS的培养基或缓冲液，同时缓慢摇动试管混匀。
4. 用含10% FBS的培养基或缓冲液补满50 mL试管。
5. 室温离心， 300 x g ；10分钟来收集细胞（G到RPM转换工具）。
6. 小心地弃去尽可能多的上清液，尽量不要搅动细胞沉淀。轻轻拍打管壁来重新悬浮沉淀。
7. 如果细胞悬液看上去混浊，计算达到终浓度为0.1 mg/mL所需的DNase I，逐滴加入DNase I并同时缓慢摇动试管混匀。在室温下孵育15分钟。
8. 加入25 mL含2% FBS的培养基或缓冲液，轻轻倒置试管混匀然后离心（转速和时间与上面的步骤相同）。弃去尽可能多的上清液然后重新温和地悬浮沉淀。
9. 如果细胞悬液看上去仍然混浊，使用一个30-70 µm的细胞滤网过滤样本并移入新的试管中。使用含2% FBS的培养基或缓冲液洗涤试管，然后使用细胞滤网过滤， 重复三次。
10. 得到的细胞悬液可以进行细胞计数和之后的下游应用，例如细胞分选。

请注意：如果是对DNase比较敏感的下游应用（例如造血细胞集落检测），进行细胞计数前再使用恰当的检测缓冲液洗涤细胞一次。

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如需要更多的样本制备方面的操作步骤和技术指导，请浏览人类免疫学专题。