囊性纤维化（Cystic fibrosis，CF）是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）的基因突变所导 致的遗传性疾病。氯离子通道广泛存在于包括肠道上皮等多种器官的上 皮组织。CFTR的缺陷导致离子通道的转运功能受损，器官粘液分泌能力 降低，引发呼吸困难，肺部感染，消化不良等多种临床症状。肠类器官的 培养为体外研究CFTR蛋白功能提供了一种全新的技术手段。欲建立肠类 器官培养，可以取结直肠样本，扩增并长期维持培养于体外培养环境中。 这些类器官在体外培养下能够维持其亲本的基因型和表型，故而可以保留 研究所需CFTR功能。

将肠类器官培养中加入forskolin会导致细胞cAMP（cyclic adenosine monophosphate）的水平急速上升，促进CFTR通道张开。当氯离子穿过通 道进入内腔后，类器官将会由于水渗透量（osmosis）的增加而不断肿胀。 通过这个原理，我们可以对CFTR的活性的进行试验。类器官肿胀与CFTR 的活性有关，CFTR野生型的类器官在经过forskolin处理后体积将增大，而 携带CFTR突变或使用CFTR抑制剂的类器官体积将不会变化。

下文介绍了使用Forskolin诱导源自健康人供体培养在IntestiCult™类器官 生长培养基（人）（产品号 #06010）的结直肠类器官的操作流程。需要了 解完整的类器官培养教程，请同时参阅本流程以及相关的产品信息表（文 件号 #DX21423）

Forskolin诱导的肠类器官膨胀

1. 根据产品信息表（文件号 #DX21423）介绍的方法，建立类器官培 养。在进行forskolin诱导实验之前，先将类器官转移至IntestiCult™ 类器官生长培养基（人）（产品号 #06010）培养3-5天。
2. 吸出培养基，加入等体积Krebs-Ringer Bicarbonate buffer（KRB）， 使KRB与Corning^® Matrigel^®的液滴在37℃充分融合30分钟。
   
   注：Forskolin诱导的膨胀试验也可以在培养基中进行，不过在KRB 中，其膨胀效果更明显。
3. 可选：如果选择设置CFTR抑制剂对照组（例，CFTR_INH172或GlyH101），请在孔中加入适量抑制剂，37℃孵育3小时。如果未设置抑 制剂对照组，请直接进行步骤4。
4. 由于类器官可能在加入forskolin后马上膨胀，请拍摄加入forskolin 前T=0的照片。
5. 吸出KRB，再加入新鲜的KRB。在其中添加阴性对照组试 剂，forskolin（10 μM），以及CFTR抑制剂（可选）。
6. 每隔固定时间拍摄一次孔内类器官，直到forskolin实验组膨胀完全 停止（通常80-120分钟）。
7. 使用ImageJ，分析计算各时间点类器官的平均面积，与T=0时作比 较，类器官膨胀的百分比。