本技术公告中，我们描述了一种全自动的细胞分选方法，用于从人全血样本中分离淋巴细胞（T和B细胞）和髓系细胞进行嵌合分析。

背景介绍

谱系特异性嵌合分析是监测异体造血细胞移植（allo-HCT）结果的重要工具。包括研究受体外周血或骨髓中供体白细胞在特定细胞亚型中的存在情况^1,2。由于患者可能在一个细胞系中表现出完全嵌合，而在另一个细胞系中表现出部分嵌合，因此，与分析整个白细胞群相比，谱系特异性嵌合分析更有优势，是一种越来越普遍的做法^3,4。进行嵌合分析需要灵敏且可靠的技术，并且保证样本之间没有交叉污染对于下游成功的嵌合分析至关重要。

嵌合分析往往是通过使用小量血液样本进行的，并且要对纯化的细胞亚型进行分析就需要能从一EasySep™，提供了一种快捷、简单的方法来获得高纯度的细胞（图1）。此外，EasySep™试剂有灵活的操作步骤可从同一样本中分离出多种细胞类型。

为了帮助实验室节约时间和提高实验室的产量，EasySep™可通过RoboSep™仪器实现全自动。RoboSep™仪器使用单独的磁极和一次性枪头减少了样本交叉污染的风险，并能得到足够多的高纯度细胞以用于下游流式检测和DNA分析。

方法：从单一样本中全自动分选多种细胞类型

以下我们描述使用RoboSep™-S，全自动的细胞分选平台，从人全血样本中依次分离淋巴细胞（T和B细胞）和髓系细胞。RoboSep™-S分选仪使用EasySep™无柱免疫磁珠分选技术，自动执行所有标记和分选步骤。分选所得细胞可立即用于任何下游实验。

RoboSep™-S的内部转盘分成四个象限（见第三页底部），每个象限有一个EasySep™ 磁极和指定的放置样本、废液管、EasySep™试剂和过滤枪头盒的空间。模块化的系统使得RoboSep™-S可以同时处理4个样本或者从一个样本中依次分选出4种不同的细胞。

样本制备

RoboSep™-S分选仪可分选全血和白膜层样本，全血样本在进行自动分选前需要预处理。准备全血样本时，首先将样本收集到含有抗凝剂的采血管中，再将最多4.5mL全血转移到14mL圆底聚苯乙烯离心管中，然后按1:1比例加入EasySep™红细胞裂解液（产品号 #20110)。接着就可以在RoboSep™-S分选仪上加载样本了。

准备白膜层样本时，将等体积的缓冲液（含2%FBS和1mM的EDTA的PBS）加入到全血中。关闭离心机刹车，800 x g，室温（15-25°C）离心10分钟。收集浓缩的白细胞层（即白膜层），由于白细胞层体积小难以吸取，可能在收集到的白膜层中会含有少量血浆和红细胞（RBCs），并不影响下游实验。这一步是为了在保持相同的血细胞比容时是将白细胞浓缩大约5倍（如：从10mL全血中能收集2mL白膜层）。按照以上稀释全血的比例稀释白膜层。

使用RoboSep™全自动分选细胞

B细胞（CD19+）、T细胞（CD3+）和髓系细胞（CD33+CD66b+）的标记和依次分选能通过RoboSep™全自动完成（图 2）。这三步过程通过使用EasySep™试剂从整个全血或白膜层样本中进行阳性选择。首先，第一个象限的样本中的细胞被靶向CD19+细胞的抗体复合物标记。经过短暂的孵育后，在样本中加入磁珠，再孵育一段时间。接着，样本中被标记的CD19+细胞与磁珠相连被转移至位于第一象限的限磁极中的试管。由于磁场的作用，被标记的细胞被保留在试管中，包含未标记细胞的上清液被转移至第二象限的样本管中。分离出的CD19+细胞则被保留在第一象限的磁极中的试管里。

接着，在第二象限中去除CD19的上清液被CD3抗体复合物和磁珠标记，将其转移至第二象限磁极的试管中。在磁极中短暂孵育样本后，去除了CD19和CD3细胞的上清被转移到第三象限的样本管中，而高纯度的CD3+细胞则被保留在第二象限磁极的试管里。

最后，包含髓系细胞的剩余部分被CD33抗体和CD66b抗体复合物及磁珠标记，然后被转移至第三象限磁极的试管中。未被标记的细胞被转移至废液管，高纯度的髓系细胞则被保留在第三象限磁极的试管里。上述方法进行细胞分选的过程中，使用的试剂包括：EasySep™ HLA嵌合全血CD19正选试剂盒（产品号 #17874），EasySep™ HLA嵌合全血CD3正选试剂盒（产品号 #17871）和EasySep™ HLA嵌合全血髓系细胞正选试剂盒（产品号 #17884）。

实验结果

使用RoboSep™从单一样本中全自动依次分选的细胞具有高纯度和高回收率（图3，表1）。即使是小体积的起始样本也能得到足够的基因组DNA用于下游嵌合分析（表2）。

总结

• 使用RoboSep™可以从同一全血样本中依次分离多达四种细胞类型。
• 无需分离柱。
• 整个过程只需最多2小时。
• 在RoboSep™仪上加载全血样本和试剂后，就可以收集所有分离的细胞类型。
• 由于使用不同的枪头分离每一种细胞，因此不会造成交叉污染。
• 无需进行Ficoll™离心或富集后的裂解步骤。
• 获得的目的细胞具有高纯度、高活率（96-99%）和高回收率。
• 可从少量的血液样本（包含 2 x 10⁶ - 3 x 10⁷个细胞的0.5 - 4.5 mL血液）中分离足够的细胞，用于下游流式分析和DNA分析。

RoboSep™仪器能轻松整合于所有实验室的工作流程中，对多样本的分选能兼顾处理的样本量、分选速度及可靠性，并具有自动分选的便利性。