EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
鉴定2型先天性淋巴细胞的设门策略
鉴定2型先天性淋巴细胞的设门策略
- Document # 27030
- Version 2.1.0
- 8/28/20
背景介绍
2010年开始的研究中，几个研究小组鉴定出少数具有淋巴细胞特征但缺乏谱系标记（Lin-）和重新排列的抗原特异性细胞表面受体的免疫细胞1,2。这些细胞分别以不同的名称来指代，例如自然辅助细胞3,4，nuocytes5，先天性淋巴细胞6和二型先天辅助细胞7。2013年提出了统一的命名法，将这些细胞分类为II型先天性淋巴细胞（ILC2）8。 ILC2是ILC家族较大的一部分，根据这一新的命名方法，于是将ILC分为了三大类：1型ILC（ILC1s），2型ILC（ILC2s）和3型ILC（ILC3s）8。这些分类是基于转录因子表达，表面受体和细胞因子分泌谱，它们分别反映了T辅助细胞亚群Th1，Th2和Th17的谱。因此，ILC2s产生与Th2相关的细胞因子，包括白介素（IL）-4，IL-5，IL-9和IL-13，并参与2型免疫应答（图1）。通过表面染色，人ILC2s对谱系标记物呈阴性，而对CD45，CD294，CD127和CD161呈阳性。小鼠ILC2s的谱系标记物为阴性，而CD45，ICOS和ST2的阳性（处于不同水平）。自从它们最初被鉴定以来，我们现在知道ILC2s是涉及先天免疫的重要效应细胞，并且是抗蠕虫免疫，过敏性炎症和组织修复所必需的1。有关不同ILC亚群（包括ILC2s）的发育，生物学和功能的更多信息，请参见相关文献1,2,9,10。
图1. 2型先天性淋巴样细胞（ILC2s）
ILC2s对多种刺激作出反应，包括存活细胞因子（Survival cytokines，例如IL-2，IL-7和IL-9）和警报蛋白（Alarmins, 例如IL-33，IL-25和TSLP）。 然后ILC2s产生2型细胞因子，包括IL-4，IL-5，IL-9和IL-13，从而促进巨噬细胞（Macrophage），B细胞，CD4+ T细胞，嗜碱性粒细胞（Basophils），嗜酸性粒细胞（Eosinophil），肥大细胞（Mast Cell），树突状细胞（Dendritic）和上皮细胞（Epithelial Cells）的活化 。 GM-CSF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子； IFNγ，干扰素-γ； IL，白介素； TSLP，胸腺基质淋巴细胞生成素。
挑战
ILC2s在人体中广泛分布。它们主要在皮肤，肠和肺等屏障表面表达丰富，也存在于脂肪组织和外周血中1。尽管在不同组织中都发现了ILC2s，但它们的表达仍不到人类和小鼠白细胞总数的1%11,12。 通常，ILC2s和ILCs的存在频率低且缺乏特定的表面标记，以至于在鉴定，分离和进一步表征这些细胞时遇到了很多挑战。目前，普遍是使用多色流式细胞仪来分离ILC2s，但是这种分选方法耗时久，价格昂贵并且分离得到的细胞回收率低。为了应对这一挑战，STEMCELL Technologies开发了RosetteSep™和EasySep™细胞分选技术从人和小鼠组织中富集ILC2s细胞群（请参见第4页）。 ILC2s的预富集将减少细胞分选时间并提高纯度和回收率。接着可使用流式细胞仪对富集的ILC2s进行进一步的分析或分选。
鉴定人和小鼠ILC2s的设门策略
细胞预富集和抗体标记
传统的方法是通过流式细胞术对ILC2s进行分选或分析，首先要收集目标组织并使用合适的方法制备单细胞悬液。然后将整个样本用适当的荧光染料偶联抗体和活性染料标记。表1和表2分别展示了标记人和小鼠细胞的推荐抗体。请注意，人和小鼠ILC2s均被定义为谱系阴性（Lin-）细胞。为了更轻松地对-细胞群进行设门，请确保所有识别谱系标记的抗体都具有相同的荧光染料（例如FITC）。 后续还可以继续使用流式细胞仪对稀有ILC2s进行分析或分选。
由于ILC2s的含量较少，因此我们建议使用EasySep™或RosetteSep™ ILC2富集试剂盒（请参见第4页）进行预富集步骤，然后再用荧光染料偶联的抗体标记细胞。通过去除大量不需要的细胞并预富集ILC2s，您可以更快地处理样本，并改善流式细胞仪分离ILC2s的低回收率问题。
人血液中ILC2s的鉴定
图2显示了从未富集和富集的人全血样本中鉴定人ILC2s的设门策略。该设门策略也可用于分析从白细胞单采样本中得到的细胞（未显示） 按图2所示的设门策略，从SSC-A与FSC-A点图开始，并根据细胞颗粒度和细胞大小圈定一个包括所有白细胞的门。 或者，仅在淋巴细胞（未显示）周围圈定一个较小的门。 分离细胞时，使用FSC-W与FSC-H或SSC-W与SSC-H点图（未显示）去除双峰并在单个细胞上进行设门。 然后，选择活细胞，再选择CD45+细胞。 接下来，在Lin- CRTH2+（CD294）细胞群上圈定一个门。在该细胞群中，ILC2细胞群呈CD127和CD161阳性。
图2. 人血样中ILC2s的设门策略
如第4页所示，使用RosetteSep™人ILC2富集试剂盒（产品号 #15382）富集细胞。对于未富集的样本，使用密度梯度离心从人全外周血中分离细胞。富集的细胞中ILC2s（Lin-CD45+ CD294+CD127+ CD161+）的含量通常在0.44-53％（取决于供体）。本示例中，未富集和富集后细胞中ILC2s的含量分别为0.02％和12％。 使用FCS Express 5软件（De Novo软件）生成FACS图。
表1. 用于人ILC2s的流式细胞分析和细胞分选抗体
小鼠肺中ILC2s的鉴定
图3显示了从未富集和富集后小鼠肺来源的单细胞悬液中鉴定ILC2s的设门策略。该设门策略可应用于其他组织的细胞。但是，起始含量和细胞类型在不同组织之间会有所不同。因此，ILC2s可能会有不同的特征，且其图示可能与图3所示略有不同。从SSC-A与FSC-A点图开始，圈定一个包含所有白细胞的门。或者，仅在淋巴细胞周围圈定一个较小的门（未显示）。分离细胞时，使用FSC-W与FSC-H或SSC-W与SSC-H点图去除双峰并在单个细胞上进行设门操作。然后，选择活细胞和CD45+细胞。接下来，在Lin- ICOS+细胞群上创圈定一个门。在该细胞群中，ILC2细胞群呈CD90和ST2阳性。来自小鼠肺的ILC2s表达Lin-，CD45+，ICOS+，ST2+，CD90+。 ILC2s中转录因子GATA-3的表达也呈阳性。用于鉴定小鼠ILC2s的其他标记包括KLRG1，CD127和c-Kit3,4
已有数据显示小鼠鼻腔注射IL-33可以增加其肺中ILC2的含量12。为了熟悉ILC2的富集和分选，可以将IL-33处理过的肺用作阳性对照（图4）。
图3. 小鼠肺中ILC2s的设门策略
如第4页所示，使用EasySep™小鼠ILC2富集试剂盒 （产品号 #19842）富集来自C57Bl/6J小鼠肺组织的单细胞悬液，图左侧是未富集的单细胞悬液。富集的细胞中的ILC2含量（Lin-CD45+ICOS+ST2+）通常为2.2-7.1%。该示例中，未富集和富集细胞中ILC2s的百分比分别对应于CD45+细胞的0.8%和16.65%。使用FCS Express 5软件（De Novo软件）生成FACS图。
图4. 来自Naive 和IL-33处理的小鼠肺中的ILC2s
如前所述，从naïve或经IL-33处理的C57Bl/6J小鼠肺中分离ILC2s13。合并多个肺（未富集的样本），然后使用EasySep™小鼠ILC2富集试剂盒（产品号 ＃19842）富集一部分的合并样本。
表2. 用于小鼠中ILC2s的流式细胞分析和细胞分选的抗体
分选前进行ILC2预富集的优势
- 使用EasySep™或RosetteSep™富集细胞，无需分离柱。
- 缩短分离细胞的时间。
- 提高ILC2s的纯度和得率。
EasySep™操作步骤
- 将EasySep™富集抗体混合物添加到单细胞悬液中。
- 将EasySep™磁珠添加到细胞悬液中。
- 将流式管放入EasySep™磁极中3分钟。*
- 将目的细胞倒入新的试管中。 重复步骤3和4。
富集的ILC2s可用抗体标记。
*所示时间是使用EasySep™紫色磁极的操作时间。时间会因具体试剂盒和所使用的磁极而有所不同。
RosetteSep™ Protocol
- 添加RosetteSep™富集抗体混合物。
- 加入到密度梯度离心液面上。
- 离心20分钟。‡*
- 洗涤并收集细胞。
*所示时间是使用RosetteSep™人ILC2富集试剂盒的操作时间。
**使用SepMate™可以在开启离心机刹车的情况下将离心时间缩短到10分钟。
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