引言

CRISPR-Cas9是一种RNA引导的基因组编辑技术，能够轻松有效地对哺 乳动物细胞进行遗传操作，因此它对细胞生物学的研究具有划时代的意 义。通过对特定基因或调节区域的靶向修饰，研究人员现在可以快速生 成精确的遗传模型，以研究正常和患病的细胞生理学。除了用于研究目的 的基因操作之外，CRISPR-Cas9基因组编辑技术还在临床治疗领域有巨大 的潜力，包括免疫治疗和再生医学。以下内容阐述了针对人原代T细胞的 CRISPR-Cas9基因组编辑的说明，包括编辑前和编辑后培养条件的优化以 及评估基因组编辑效率的方法。

图1展示了CRISPR-Cas9基因组编辑的机制。简单来说，通过相关的CRISPR RNA（crRNA）在与原间隔序列临近基序（PAM）（化脓性链球菌Cas9为 NGG）上游5’位点的碱基互补配对，将Cas9内切核酸酶靶向目的基因组 位点。crRNA与反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）结合为与Cas9相互作用 的二聚体，以形成向导RNA（gRNA）。Cas9与gRNA形成复合物后，即可 靶向目的基因组位点，并在PAM序列的上游进行切割，产生3至4个碱基 的DNA断裂。接着内源性DNA修复系统开始修复断裂的DNA。非同源末 端连接（NHEJ）介导了断裂DNA分子的直接连接，由于NHEJ的易出错特 性，这可导致插入或缺失（INDEL）突变的形成。如果提供供体DNA序列 模板，则可以通过同源定向修复（HDR）途径实现精确DNA序列的敲入（ 图1）。

尽管这项技术已成功应用于很多细胞系中，但在原代人免疫细胞中的应 用却遇到了CRISPR-Cas9组分的高效传递和表达这两项极大的挑战。早 期尝试将CRISPR-Cas9用于原代人T细胞的基因组编辑时，使用了病毒载 体^1,2 或质粒^3,4表达Cas9和gRNA，导致低靶向效率和高毒性。由于不想要 的基因突变和免疫原性的风险，这些表达系统也可能影响临床转化的安 全性。最近，用重组蛋白Cas9和体外转录（IVT）或合成gRNA制备的核糖 核蛋白（RNP）复合物对活化的T细胞进行电转，已在许多靶标中实现了高 功效^6-10。在许多细胞类型中，包括人T细胞，体外转录的gRNA都会引起高 细胞毒性，这是因为5’三磷酸单链RNA（ssRNA）激活了I型干扰素介导的 免疫反应¹¹。因此，基于RNP的方法会优先选择使用合成gRNA。ArciTect™ 是基于RNP的CRISPR-Cas9表达系统，包括定制的合成gRNA，旨在完全支 持人原代T细胞的基因组编辑。

除CRISPR-Cas9表达方法外，用于扩增和激活人原代T细胞的培养系统 也是成功进行基因组编辑的关键要素，因为在大多数实验中都需要激 活细胞¹²。尽管可以使用多种分离技术从不同样本来源分离T细胞，但 迄今为止，涉及T细胞的大多数基因组编辑研究都使用免疫磁珠分选 技术从外周血单个核细胞（PBMC）中分离的人原代T细胞^{7, 12-14}

通过对表达和传递方法的改进，CRISPR-Cas9基因组编辑现已被迅速 纳入下一代免疫疗法的开发中。比如：嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗 法，其中CRISPR-Cas9能够产生与适用于患者输入的同种异体免疫效 应细胞¹⁵。因此，可以通过敲除内源性T细胞受体（TCR）和人白细胞 抗原（HLA）I类分子来改造T细胞，以避免免疫排斥反应，在抑制性受 体（如程序性死亡1（PD-1）或细胞毒性T淋巴细胞抗原蛋白4（CTLA-1 ））缺失的情况下，这种经改造后的T细胞效率会更高^9-10,16-17。接着将 CAR构建体靶向内源TCR α恒定区（TRAC）基因位点¹⁸，以产生通用的 同种异体CAR-T细胞。

以下操作流程阐述了有关人原代T细胞的分离与激活，CRISPR-Cas9 RNP复合物的制备以及使用电转将RNP复合物导入激活的原代T细胞 中的步骤（图2）。这里我们将介绍一种生成基因敲除原代T细胞的高 效方法，以及有关在多个激活条件下对TCRαβ基因座进行CRISPRCas9基因组编辑的数据。查看本文档的讨论部分，了解替代策略、预 期结果以及对流程的修改。

在原代人T细胞上进行CRISPR-Cas9基因组编辑

所需材料

A. T细胞分选和激活

1. 使用EasySep™人T细胞分选试剂盒（产品号 #70500）从外周血分 离人T细胞。具体操作请参考产品说明书（PIS，#DX20004)
   
   可选：此外，可使用冷冻原代T细胞（产品号 #70024）。具体信息 请参考产品说明书（PIS，#DX27569)。
2. 对细胞进行计数并将其浓度调整为1 x 10⁶cells/mL后，接种至含 有2 mM L-谷氨酰胺，50 μg/mL庆大霉素和10 ng/mL（特定批次 为130 IU/mL）人重组IL-2细胞因子的ImmunoCult™-XF T细胞扩 增培养基中。
3. 加入25 μL/mL的ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂来激活 T细胞。在37℃和5% CO₂条件下孵育细胞悬液72小时。
4. 可选：通过将激活标志物CD25与抗人CD25抗体（克隆号 BC96，产品号 ＃60158）结合并进行流式细胞术来测定T细胞的 激活状态。

B. 准备ArciTect™ crRNA和ArciTect™ tracrRNA的母液

1. 打开ArciTect™ crRNA和ArciTect™ tracrRNA前简单离心。
2. 按照表1，加入无核酸酶水制备终浓度为200μM的试剂。



表1. 制备200μM* ArciTect™ crRNA 或 ArciTect™ tracrRNA

ArciTect™ crRNA 或 ArciTect™ tracrRNA

产品号 #

无核酸酶水体积 (µL)

2 nmol

76010/76016A

10

10 nmol

76011/76017A

50

20 nmol

76012/76018A

100




*200 μM等同于200 pmol/μL



3. 混合均匀。如果不立即使用，可进行分装并在-80℃下储存长达1 个月。解冻后，应立即使用。切忌反复冻融。

准备ArciTect™ CRISPR-Cas9 RNP复合物

1. 如表2所示，在RNase-free微量离心管中混合各个组分以制备 60μM gRNA。该体积足以进行一次电转实验，请根据需要调整 试剂用量。混合均匀。



表2. 制备60μM gRNA

组分

体积/电转 (μL)

无核酸酶水

2

ArciTect™退火缓冲液（5X）

2

200 µM ArciTect™ crRNA

3

200 μM ArciTect™ tracrRNA

3

总体积

10


2. 在热循环仪或加热块中，将gRNA混合物在95℃下孵育5分钟，然 后在60℃下孵育1分钟。冷却至室温（15-25℃），再置于冰上。
   注意：如果不立即使用，可在-80℃下保存长达1个月。
3. 如表3所示，在RNase-free微量离心管中混合60 μM gRNA（步骤 2中制备）和ArciTect™ Cas9核酸酶（或ArciTect™ Cas9-eGFP） 以制备RNP复合物。这些试剂足够进行一个孔的电转，如果需要 进行更多电转，请按比例调整体积。




表3. 制备RNP复合物混合物

组分

体积/电转（µL）

重悬缓冲液T

6.8

4 μg/μL ArciTect™ Cas9核酸酶*

7.2

60 µM RNA

6

总体积

20




如果使用3μg/uL ArciTect™ Cas9-eGFP核酸酶，对于每次实验所需的20μL体积，加 入11.4μL Cas9-eGFP到6 μL的60 μM gRNA和2.6μL重悬缓冲液T中。



4. 轻轻上下吹打两次以混合RNP复合物混合物，避免试管内产生 气泡。
5. 室温（15 - 25℃）孵育RNP复合物混合物10-15分钟。

D. 使用RNP复合物对T细胞进行电转

1. 对一次电转（包括阳性和阴性对照），准备含有2 mM L-谷氨酰 胺，50μg/mL庆大霉素和10 ng/mL人重组IL-2细胞因子的2 mL的 ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基。
2. 对每一次电转，在6孔板的每孔中加入2 mL于步骤1中准备的补 充培养基，并在37℃下进行孵育。剩余的补充培养基置于2 - 8℃ 下保存。
3. 在15 mL锥形管中加入1.2 x 10⁶被激活的T细胞悬液（经步骤A制 备），于室温下以300 x g离心5分钟。
4. 吸除培养基并在100μL重悬液T中重悬细胞。
5. 对每一次电转使用单独的RNase-free离心管，按照表4将RNP复 合物混合物（经步骤C制备）与激活的T细胞混合。

表4. RNP混合物和T细胞混合用于电转

组分

体积/电转（µL）

RNP复合物

20

激活的T细胞悬液

100

总体积

120


6. 用移液枪轻轻上下吹打两次，避免试管内产生气泡。
   注意：如果有气泡，电转时细胞的活力和转染效率会显著下降。
   
   注意：参考电转仪器生产商的说明书。针对不同的细胞系可能需 要进行电转条件的优化。
7. 使用100μL Neon®枪头，吸取100μL混合物，放入具有3mL电解 缓冲液E2的电转室中。使用表5中的设置对混合物进行电转。



表5. 使用Neon®对人T细胞进行电转的推荐条件

脉冲数

电压

1400V

脉冲宽度

30 milliseconds

脉冲数

1


8. 电转结束后，立即将电转的细胞加入步骤2准备的6孔板的一个 孔中，于37℃和5% CO₂下孵育2-3小时。
9. 对细胞进行计数并将细胞浓度调整为2.5 x 10⁵活细胞/mL，接种 至含有人重组IL-2细胞因子的ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养 基中（步骤1中制备）。
10. 可选：若使用Cas9-eGFP核酸酶，可以通过流式在电转后12 - 24 小时评估转染效率。
11. 电转后，细胞需在37℃和5% CO₂下孵育48 - 72小时，以便基因 编辑发生。收集细胞，评估基因组编辑效率。可使用ArciTect™高 保真DNA聚合酶试剂盒（产品号 #76026）和针对靶点区域附近 的引物对基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增后的产物进 行测序。或者，可以使用ArciTect™ T7核酸内切酶I试剂盒（产品 号 #76021）对经PCR扩增后的产物进行编辑效率（% INDEL形成 率）的评估。有关详细信息，请参阅技术手册：评估基因组编辑效 率（文档号 #27126），可从我们的网站 www.stemcell.com获 取或联系我们索取副本。

案例分析：评估对人原代T细胞高效敲除TRAC的最佳培养方法

为了证明使用ArciTect™ CRISPR-Cas9系统的基因敲除，我们使用上文中描述的方法靶向TRAC位点。此外，我们测试了多种T细胞激活剂及其动力学 以找出具有最高敲除效率的体系。通过细胞表面没有TCR表达可轻松识别该位点由于INDEL引起的功能缺失。最重要的是通过靶向此基因座产生用 于CAR T细胞疗法的通用型同种异体T细胞¹⁸。

首先，我们设计了多个crRNAs（图3A，D），因为不同的crRNA序列可以在靶位点上表现出不同的效率（请参阅技术公告：设计Cas9 RNP直接传递的 基因组编辑的注意事项，文档号 #27083）。我们测试了4种crRNA在激活的人T细胞中的效率，并且通过流式细胞仪检测了TRAC敲除效率，以及通 过ArciTect™ T7核酸内切酶I试剂盒检测了INDEL的生成。所有的这四个crRNAs均显着降低了TCRαβ⁺细胞信号的频率（图3B），并在T7核酸内切酶I 分析（图3C）中显示出切割条带，从而证实了存在由于INDELs而导致的基因组错配。根据以上结果，crRNA2在流式细胞分析中显示出最高的敲除效 率，因此其被用于进一步的研究

接着，我们使用已经验证的crRNA2来比较各种T细胞激活条件下的敲 除效率。首先，从四个独立捐献者的外周血中分离出T细胞。分离出的 细胞在含有ImmunoCult™人CD3/CD28或CD3/CD28/CD2 T细胞激活 剂的Immunocult™-XF T细胞扩增培养基中培养2或3天，总共四个测 试条件。在第0天，大约10-20％的细胞表达了激活标记物CD25（数据 未显示），在激活2或3天后，其表达增加到80％以上（图4）。相比于 CD3/CD28 T细胞激活剂，CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂的激活效果更 好（图4）。细胞被激活3天后，活化细胞的百分比更大（图4）。欲了解 更多关于T细胞激活和扩增条件优化的详情，请参考技术公告：人T细 胞扩增流程优化：早期细胞稀释的影响（文档号 #27143），可从我们 的网站www.stemcell.com获取或联系我们索取副本。

激活后，用包含TRAC crRNA2的RNP复合物对T细胞进行电转。电转后细胞活率为52-82%（数据未显示），与激活条件无关。电转3天后（激活开 始后的第5或第6天）测定敲除效率，我们观察到敲除效率高达90%（TCRαβ细胞，图5A）。在激活3天后进行电转的敲除效率最高，尤其是在使用 ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂时（图5A）。此外，通过T7核酸内切酶I分析证实了来自所有4个供体经处理的样本中靶位点都有INDEL的形 成（图5B）。使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂培养2天后，供体之间的结果具有较大差异，其中一个样本没有反应。因此，我们使用 相同的条件测试了另外4个供体，并在这些样本中观察到较一致性的敲除结果。由于TCRαβ与CD3形成复合物，可通过在细胞表面上同时缺失CD3 的表达来确认基因敲除（图5A，C，D），而T细胞标记物CD4和CD8继续高表达（图5E）。

进行CRISPR-Cas9基因组编辑后，将细胞接种至含有IL-2的Immunocult™-XF T细胞扩增培养基中再培养10天，每2-3天进行换液。TCRαβ细胞在扩增 过程中一直存在（数据未显示）。相比于使用ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂处理的细胞，在电转前使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T 细胞激活剂处理的细胞在基因编辑后显示出更高的扩增能力。电转后孵育7天，根据扩增倍数计算得出的细胞含量为4.1 x 10⁷ 至3.8 x 10⁸ 个细胞。

讨论

对原代人T细胞进行基因编辑时，细胞凋亡、细胞活率和基因编辑效率之间存在一定的平衡。我们发现电转前使用ImmunoCult™人CD3/CD28 T细 胞激活剂活化3天会得到最高且最一致的编辑效率。而用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂刺激的细胞，在编辑后有更强的细胞扩增能 力。因此在选择操作流程时，应考虑下游应用所需要的细胞数量。如果下游应用需要大量编辑的细胞，那么可以在每次电转中按比例增加细胞或者 是增加更多的培养孔。通常，推荐使用两个孔作为阳性对照（例如ArciTect™人HPRT阳性对照试剂盒，产品号 #760134）和阴性对照（未电转）。应在 实验之前决定使用孔的数量以便计算需要的试剂总数。可能还需要考虑其他优化条件，例如细胞密度或Cas9：gRNA的比例，或者可能需要多个供 体样本（例如：患病和健康供体）。

本文所列举的基因组编辑策略适用于大多数基因敲除应用。特定应用的操作步骤调整（此处未详细介绍），可能包括：使用ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶（产品号 #76005）进行阳性转染的可视化；单链核酸内切酶ArciTect™ Cas9（产品号 #76007）与两个邻近gRNA一起使用；或加入一个DNA 供体模板以进行同源性直接修复（HDR）介导的基因敲入。