多能干细胞（PSCs）具有无限增殖和分化成其他类型细胞的潜能，通过将PSCs分化为自然杀伤细胞、巨噬细胞或T细胞等免疫细胞可以为免疫细胞治疗提供不竭的细胞来源。本期文章，STEMCELL将详细阐述如何从多能干细胞生成T细胞的具体实验方案，希望能为您的研究提供帮助。

材料：

• STEMdiff™ T细胞试剂盒 (产品号 #100-0194)
• Y-27632 (产品号 #72302)
• AggreWell™400 Plate (产品号 #34421)
• 抗粘附冲洗液 (产品号 #07010)
• 含15 mM HEPES的DMEM/F-12 (产品号 #36254)
• ACCUTASE™ (产品号 #07922)
• 37 µm细胞过滤器 (产品号 #27250)
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• II 型胶原酶 (产品号 #07418)
• TrypLE™ Express (Thermo Fisher #12605010)
• EasySep™人CD34正选试剂盒II (产品号 #17856)
• UM729 (产品号 #72332)
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实验方案：

第一部分：将PSCs分化为CD34+细胞

1. 准备EB培养基A（STEMdiff™造血 - EB基础培养基 + STEMdiff™造血 - EB添加物A）。将10 µM的Y-27632添加到EB培养基A中，制备EB形成培养基。
2. 使用抗粘连冲洗液以及含15 mM HEPES的DMEM/F-12冲洗AggreWell™400培养板，并添加一半体积的EB形成培养基。
3. 使用ACCUTASE™收集PSCs并生成单细胞悬液。
4. 在2.5 mL EB形成培养基中将PSCs稀释至1.4 x 10⁶个细胞/mL，然后接种到步骤2准备的AggreWell™培养板中
5. 第二天用EB培养基A进行半培养基更换。
6. 准备EB培养基B（STEMdiff™ 造血 - EB 基础培养基 + STEMdiff™造血 - EB添加物B）。
7. 第3天用EB培养基B进行半培养基更换。
8. 在第5天收集EBs，然后通过37 µm细胞过滤器并使用EB培养基B过滤洗脱EBs。
9. 将洗脱的EBs转移到未进行TC处理的培养板中。
10. 在第7天添加EB培养基B。
11. 在第10天用EB培养基B进行半培养基更换。
12. 收集EBs并使用II型胶原酶和TrypLE™ Express解离成单细胞悬液。使用 EasySep™人CD34正选试剂盒II分离CD34⁺细胞。

第二部分：将PSC来源的CD34+细胞分化为DP T细胞

1. 用StemSpan™淋巴细胞分化包被试剂包被未进行TC处理的培养板；请参阅技术手册 #10000007541) 了解完整说明。
2. 准备StemSpan™淋巴祖细胞扩增培养基（StemSpan™ SFEM II + StemSpan™ 淋巴祖细胞扩增添加物）。
3. 在StemSpan™淋巴祖细胞扩增培养基中将CD34⁺细胞稀释至5 x 10⁴个细胞/mL，然后接种到包被的培养板上
4. 按照技术手册 （文档#10000007541) 中的说明在37°C下孵育7天，并在第7天进行半培养基更换和培养板转移。在第14天，收集淋巴祖细胞以进一步分化为DP T细胞。
5. 准备StemSpan™ T细胞祖细胞成熟培养基（StemSpan™ SFEM II + StemSpan™ T细胞祖细胞成熟添加物）。
6. 在StemSpan™ T细胞祖细胞成熟培养基中将淋巴祖细胞稀释至0.5 - 1 x 10⁶个细胞/mL，然后将细胞接种到新包被的培养板上（参见步骤 1），于37°C下孵育，并按照手册中的说明进行半培养基更换（在此阶段使用FACS法去除死细胞可能会提高DP T细胞的得率和比例）。/li>
7. 第28天，收集DP T细胞（图1）用于下游测定，或按照可选方案进行扩增培养以进一步成熟为CD8 SP T细胞。

第三部分：将成熟的DP T细胞成熟化为CD8 SP T细胞

1. 准备一个新包被的培养板（参见第二部分的步骤 1）。
2. 准备完整的CD8 SP T细胞成熟培养基（StemSpan™ SFEM II + StemSpan™ T细胞祖细胞成熟添加物 + IL-15）。详细信息请参见技术手册。
3. 添加推荐浓度减半的ImmunoCult™ T细胞激活剂。
4. 在含有ImmunoCult™ T细胞激活剂的CD8 SP T细胞成熟培养基中将细胞稀释至1 x 10⁶细胞/mL，并接种到包被的培养板上，于37°C下孵育。
5. 培养3 - 4天后，添加不含ImmunoCult™ T细胞激活剂的CD8 SP T细胞成熟培养基。
6. 在37°C下孵育7天后收集细胞。