本文档包括hPSC基因检测试剂盒的技术窍门和常见问题，应与产品信息表（PIS，文档号 #DX22330）一起参考使用。

关键步骤

• 第一次使用hPSC基因检测试剂盒，在对大规模的样本进行检测前，最好使用Genomic DNA Control和1-2样本进行实验，对整个实验流程进行熟悉。
• 按照PIS的要求，对混合物进行充分涡旋（每个样本5秒钟）。
• 使用移液枪进行移液需要精准和小心。当检测多种样本时，推荐使用排枪。

常规窍门

当第一次使用本试剂盒时

1. 在进行实验或准备qPCR Master Mix + Dye时，仔细阅读产品说明书（PIS）。
2. 第一次进行实验时，应当检测Genomic DNA Control和最多1-2个样本。当您对操作流程熟悉后，并且实验的重现性高时，再提高样本数量。
3. 将加样板的计划表格提前准备好，加样时放在面前参考。

涡旋，涡旋，涡旋！

1. 当使用DNA时，我们通常不会进行涡旋，因为它可能会导致DNA切断。虽然我们不建议涡旋genomic DNA样本的母液，但将DNA和Master Mix + Dye溶液（在步骤C5中制备）彻底涡旋5秒钟非常关键。这将有助于减少复孔之间的结果差异。
2. 同样地，步骤D3中制备的样本也应通过涡旋充分混合（每个样品5秒）。这同样有助于减少复孔间的结果差异。

Genomic DNA样本制备

1. 每次反应中的Genomic DNA量可以增加；在某些情况下，这可以提高重复实验间的重现性。
   如，与其使用含有290 ng的58 μL样本（步骤 C.4），可使用含有580ng或870 ng的58 μL样本。
2. 混合Genomic DNA和Master Mix + Dye，在C5结束时准备，在加样前涡旋均匀（每个样本5秒）。
3. 使用适当的方法确定Genomic DNA样品的浓度和质量。GenomicDNA样品的吸光度比应在A260/280~1.8-2.0和A260/230~1.9-2.2的范围内。
4. 如果样品DNA的浓度低（<5 ng/ μL），在使用hPSC基因检测试剂盒进行分析之前，使用乙醇沉淀或其他合适的方法进行浓缩可能会有帮助。检测浓度过低的DNA样本的实验重复性可能会很差并且导致难以解释的结果。

Genetic Assays

1. 引物探针的冻干粉在运输过程中可能已经分散，因此在重悬前进行离心是非常重要的。最好的情况下，重新将冻干粉沉降到管低，并直接将TE重悬缓冲液加入冻干粉上。
2. 实验前将实验体系混合均匀非常重要，尤其是在分装引物前。可在离心后轻弹离心管。
3. 分装时要小心；当从母液移液至稀释后的样本时，接触母液一定要使用干净的枪头，避免引物探针间的交叉污染。

常见问题

qPCR反应失败/没有扩增信号

所有反应均没有扩增信号：

• qPCR Master Mix（2X）中ROX Reference Dye未加入或加入量不正确。
  注意：检查qPCR Master Mix（2X）中添加了适量的ROX Reference Dye。
• 使用了错误的cycling条件。
  注意：如果不确定机器需要哪种cycling条件，请使用PIS中提供的标准cycling时间。

个别反应没有扩增信号：

• 反应中缺少一种或多种组分，包括genomic DNA，qPCR Master Mix（2X），ROX Reference Dye或Genetic Assay。
  注意：当混匀所有反应体系时；在边缘进行标记，标识是否所有的孔都有加入。
• 在qPCR软件中选择了错误的孔。
  注意：有些qPCR机器使用的软件需要预先选择孔及其内容；在执行qPCR之前请检查是否选择了正确的孔。

复孔间的实验结果差异较大

• 样本/试剂加入量不精确。
  注意：移液枪需要日常维护和校准。
• 试剂未充分混匀/涡旋。
  注意：请按照PIS中的说明，混合物应使用涡旋的方式充分混匀。
• 混合物体积不够。
  注意：如果操作的得当，步骤C中制备的genomic DNA + PCR Master Mix混合物和步骤D中制备的Genetic Assay是过量的，足够实验所用。
• qPCR板中试剂加入不正确。
  注意：当在qPCR板中加入试剂时要小心；DNA加入量不精确会影响扩增系数。