前言

人胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）可以无限自我更新并具有分 化成所有体细胞的潜能，这使得它们成为再生医学领域极具吸引力的人 体组织来源。近期的突破性进展使得基因组编辑技术变得更有效及更易 用，干细胞的无限更新及分化的潜能与基因组编辑技术相结合，让很多研 究领域的内容变得更为广泛。现在可以在细胞系中引入或纠正引起疾病的 突变，以创建或挽救疾病模型；这方面的工作也可能为体内纠正引起疾病 的突变铺平道路。

CRISPR-Cas9基因组编辑的实验设计取决于实验目的。如果实验目的是了解该基因在疾病中的普遍作用，那么经常使用到的是基因敲 除模型。或者，可以引入精确的DNA突变，将单核苷酸变体，遗传“标 签”或转基因整合到基因组中。这两种方法都需要CRISPR相关的核酸 内切酶蛋白（例如化脓性链球菌Cas9或SpCas9）和定制设计的向导 RNA（gRNA）。gRNA的功能是引导Cas9作用于基因组的目标靶点。 精确（敲入）编辑还需要添加供体DNA序列，以引入需要的特定基因 变化。通过引入在靶点附近的同源序列（也称为homology arms）将 外源DNA靶向目的位点，并且可以在Cas9介导的DNA断裂后使用供 体DNA序列进行修复连接。这种类型的实验方法依赖于同源定向修 复（HDR）途径，其通过同源重组起作用以在切割位点掺入外源序列。 这是一种高效的实验方法，因为它使研究人员能够以有针对性和特定 的方式“重写”基因组。

下面的实验流程包括如何设计gRNA和供体序列，如何制备CRISPRCas9核糖核蛋白（RNP）复合物，以及使用Mirus TransIT®-X2系统电 转的方式将其转染入ES或iPS细胞中。我们还提供了使用单链寡脱氧 核苷酸（ssODN）供体DNA序列进行敲入的相关方案。所需试剂需按 照实际实验中实际孔数进行调整。建议对每种CRISPR RNA（crRNA） 使用复孔进行检测。当靶向作用于一个新的基因时，需测试多种 crRNA，因为他们在作用于不同的靶基因的效率及脱靶率都不同。针 对一些难以转染的细胞系或难作用的基因部位，可能要进行实验条件 的优化，如调整细胞密度或Cas9:gRNA的比例。.

为了获得最佳结果，应使用高质量和适宜密度的hPSC作为起始样本， 并且去除大部分的分化区域。如何培养高质量的ES和iPS细胞，包括如 何包被培养板和使用（产品号 #85850或#05825） 的完整说 明，请参阅技术手册：在mTeSR™1或中维持培养人多能 干细胞（文档号 #28315或#DX23032），可访问www.stemcell.com。

本实验流程使用CloneR™（产品号 #05888），一种mTeSR™1/ mTeSR™ Plus添加剂，可显著提高hPSCs的克隆效率和单细胞存活 率。有关CloneR™的解冻，制备和存储的完整说明，请参阅 www.stemcell.com上的产品说明书（文档号 #DX21725）或联系我们索取 相关材料。

准备ArciTect™ crRNA和ArciTect™tracrRNA的母液

实验材料

1. 打开所有的试剂前简单离心。
2. 按照表1，加入无核酸酶水制备终浓度为200 μM的试剂。



表1. 制备200 μM* ArciTect™ crRNA或ArciTect™ tracrRNA



*200 μM为200 pmol/μL

3. 混合均匀。如果不立即使用，可进行分装并在-80℃下储存长达6个月。解冻后，应立即使用。切忌反复冻融。

使用Neon®转染系统对人ES和iPS细胞进行电转

实验材料

A. 准备培养板

下述的实验流程适用于使用24孔培养板对人ES或iPS细胞进行电转。如果使用其他的培养器皿，请对应的调整试剂用量。

1. 使用Matrigel®包被24孔板，置于室温（15 - 25℃）至少30分钟。
2. 将足量的mTeSR™1或者mTeSR™ Plus，CloneR™和ACCUTASE™预热至室温（15 - 25℃）。
3. 将CloneR™以1：10的比例添加至mTeSR™1或mTeSR™Plus，每次转染准备5 mL单细胞铺板培养基。
   举例：制备10 mL单细胞铺板培养基，将1 mL CloneR™加入9 mL mTeSR™1或mTeSR™ Plus培养基。
4. 从24孔板中吸除Matrigel®，每孔加入1 mL单细胞铺板培养基。将培养板置于37℃和5% CO2的培养箱中。

B. 制备gRNA

大约在接种ES或iPS细胞的24小时后应进行RNP的制备和转染。

1. 如表2所示，在微量离心管中制备80 μM gRNA，混合crRNA，tracrRNA和退火缓冲液。

表2. 制备80 μM gRNA


2. 在热循环仪或加热块中，将gRNA混合物在95℃下孵育5分钟，然后在60℃下孵育1分钟。冷却至室温（15 - 25℃），再置于冰上。如果不立即使用，可在-80℃下保存长达6个月。

C. 制备单细胞悬液

1. 在对数生长期收集细胞。
2. 在显微镜下识别待传代孔中的分化区域（如果有）。使用记号笔在板底标记这些区域。使用枪头或通过吸除移除这些分化区域。
3. 吸除孔中的培养基，加入1 mL ACCUTASE™（6孔板）。37℃，5%CO₂孵育大约5分钟或观察到克隆中细胞间缝隙变大。
4. 每孔加入2 mL mTeSR™1或mTeSR™ Plus。使用1000 μL的枪头，轻轻将细胞从培养板表面吹散入悬液中。对悬液上下吹打2 - 3次将小的聚集体打散为单细胞。
5. 将细胞悬液转移入15 mL离心管。
6. 300 x g，离心5分钟。
7. 吸除上清，注意不要碰到细胞沉淀。
8. 使用至少2 mL单细胞铺板培养基重悬细胞，可轻轻敲击离心管2 - 3次。
9. 使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
10. 每个电转体系，在一只新的15 mL离心管中加入3 x 10⁵个细胞。300 x g，离心5分钟。

D. 制备电转所需的ArciTect™ CRISPR-Cas9 RNP复合物

1. 要制备RNP复合物混合物，按照表3所示，在微量离心管混合所需组分。根据所需的转染次数调整组分体积。彻底混合。

表3. 制备RNP复合物混合物



*如果使用3 μg/uL ArciTect™ Cas9-eGFP核酸酶，对于每次转染所需的5 μL体系，加入1.2 μL Cas9-eGFP和3.24 μL重悬缓冲液R。注意1 μg/μL Cas9核酸酶或核酸内切酶不适用于10 μL Neon®电转，由于RNP的体系不可以超过整个反应体积的1/10。

注意：不同的细胞系可能需要优化。推荐使用Cas9：gRNA的比例在A 1：2（表中所示）到1：4。

注意：如果两个以上的gRNA需要使用（如使用ArciTect™ Cas9核酸内切酶），请分别准备对应的RNA复合物。

2. 室温（15 - 25℃）孵育RNP复合物混合物20分钟。
3. （可选）如表4所示，使用重悬缓冲液R稀释100 μM ssODN至20 μM。

表4. 制备稀释后的ssODN




4. RNP复合物制备完成后，按照表5加入2.5 μL 20 μM稀释后的ssODN或重悬缓冲液R。

表5. 使用Neon®进行人ES或iPS细胞电转的推荐条件

E. 使用RNP复合物对人ES或iPS细胞进行电转

1. 吸除C部分离心后的上清，然后轻轻敲击离心管2-3次，使细胞沉淀变得松散。
2. 对一次电转体系，使用7.5 μL重悬缓冲液R重悬3 x 10⁵个细胞，用移液枪上下吹打均匀。
3. 将7.5 μL细胞悬液加入7.5 μL完全RNP复合物（D部分第4步），上下吹打均匀。
4. 使用10 μL Neon®枪头，吸取10 μL混合物，检查管中是否有气泡，放入具有3 mL电解缓冲液E的电转室中。
   
   注意：参考电转仪器生产商的说明书。针对不同的细胞系可能需要进行电转条件的优化。
5. 使用表6中的设置对混合物进行电转。
   
   注意：参考电转仪器生产商的说明书。针对不同的细胞系可能需要进行电转条件的优化。



表6. 使用Neon®对人ES或iPS细胞进行电转的推荐条件




6. 电转结束后，立刻将细胞转入A部分准备的预热（37℃）的培养板。
7. 将培养板轻柔的前后移动2 - 3次，混匀细胞悬液。
8. 在37℃和5% CO₂孵育培养板。
9. 每24小时，使用0.5 mL室温预热的mTeSR™1或mTeSR™ Plus培养基进行完全换液。
10. 电转后，细胞需孵育48 - 72小时（如果密度太低可培养至7天），以便基因编辑发生。
11. 收集细胞，评估基因组编辑效率。可使用（产品号 #76026）和针对靶点区域附近的引物对基因组DNA进 行PCR扩增，然后对PCR扩增后的产物进行测序。或者，可以使用 （产品号 #76021）进行PCR扩增后的基因编 辑效率（% INDEL形成率）的评价。有关详细信息，请参阅技术手册：评估基因组编辑效率 （文档号 #27126），可在登录www.stemcell.com获取 或联系我们索取副本。

案例分析：将GFP转换为BFP的基因敲入优化

为了证明使用ArciTect™CRISPR-Cas9系统的基因敲除和敲入，我们针对增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记的WLS-1C iPS和H1 ES细胞系中的eGFP 基因位点进行编辑。野生型GFP序列中的单碱基取代（196T → C）可以将荧光吸收和发射转向蓝色光谱，有效地将GFP转换为蓝色荧光蛋白BFP¹。 GFP转换为BFP的效率可用于通过流式测定GFP和BFP的荧光，来定量评估敲除（NHEJ）和敲入（HDR）的效率²。GFP表达的丧失提示基因敲除 （NHEJ），而GFP向BFP的转换提示基因敲入BFP序列（图2）。

由于NHEJ是哺乳动物细胞的主要修复途径，HDR依赖的敲入编辑的效率远低于敲除效率。然而，通过对gRNA和ssODN供体序列进行设计可以优 化编辑效率。编辑效率取决于切割 - 突变距离³ 。由于Cas9切割PAM序列上游的DNA 3 - 4对碱基对，因此应仔细考虑切割位点相对所需突变的位 置。对于ssODN供体序列的设计，如果所需的敲入序列很小（1 - 2个碱基对），Cas9-gRNA RNP复合物仍然能够识别序列并参与重复的切割 - 突变 循环，直到足够的Cas9-gRNA阻断的变异产生，例如，一个INDEL，有效地降低了敲入编辑效率。为了解决这个问题，可以引入一个破坏PAM的位点 突变或3 - 4个沉默/同义突变（图2A）到供体DNA序列的设计中。

使用含有GFP crRNA和ssODN（图2A）的RNP复合物对hPSCs进行电转。敲除和敲入效率在电转72小时后进行测量，我们观测到53.2%的敲除效率 和最高3.7%的敲入效率（图3），不同的细胞系间的基因编辑效率会有不同。

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System对人ES和iPS细胞 进行转染

实验材料

A. 将待转染用的ES或iPS细胞铺板

下面的实验流程适用于收集在6孔板中培养的人ES或iPS单细胞，并 使用24孔板进行转染。如果需要使用其他的培养器皿，请对应的调整 试剂用量。

1. 使用Matrigel®包被24孔板，置于室温（15 - 25°C）至少30分钟。
2. 将适量的mTeSR™1，CloneR™，DMEM/F-12和ACCUTASE™预热至室温（15 - 25°C）。
3. 将CloneR™以1：10的比例添加至mTeSR™1，每次转染准备5 mL单细胞铺板培养基。
   举例：制备10 mL单细胞铺板培养基，将1 mL CloneR™加入9mL mTeSR™1。
4. 从包被的培养皿中吸除基质，每孔加入0.5 mL单细胞铺板培养基。
5. 在显微镜下识别待传代孔中的分化区域（如果有）。使用记号笔在板底标记这些区域。使用枪头或通过吸除移除这些分化区域。
6. 吸除孔中的培养基，加入1 mL ACCUTASE™。37℃，5% CO₂孵育大约5分钟（不同细胞系间的孵育时间可能会有所变化）。
7. 使用1000 μL的枪头，轻轻将细胞从培养板表面吹散入悬液中。对悬液上下吹打2 - 3次将小的聚集体打散为单细胞。
8. 将细胞悬液转移入含有至少5 mL DMEM/F-12的15 mL离心管中，可轻轻敲击离心管2 - 3次。
9. 300 x g离心5分钟，吸除上清，使用1 mL 单细胞铺板培养基重悬细胞沉淀。
10. 使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
11. 将1.25 x 10⁵个细胞加入到第4步准备的培养板中。将培养板前后左右快速摇晃几次，使细胞分布均匀。
    
    注意：不同的细胞的最佳细胞密度可能不同，需要参考细胞收集时的情况（通常是铺板后48 - 72小时）。
12. 37℃，5% CO₂孵育24小时。图1为孵育24小时后细胞形态的代表性图像。

B. 制备化学转染所需的ArciTect™ CRISPRCas9 RNP复合物

RNP的制备和转染应在ES或iPS细胞铺板后24小时进行。

1. 如表7所示，在微量离心管中制备5 μM gRNA，混合crRNA，tracrRNA和退火缓冲液。下面配置的实验试剂足够对24孔板的4个孔进行转染。完全混合。
2. 使用热循环仪或加热块，将gRNA混合物在95℃下孵育5分钟，然后在60℃下孵育1分钟。冷却至室温（15 - 25℃），再置于冰上。如果不立即使用，可在-80℃下保存长达6个月。



表7. 制备5 μM gRNA


3. 按照表9，在微量离心管中配置5 μM Cas9核酸酶溶液。这些试剂足够进行一个孔的转染，如果需要进行更多转染，请按比例调整体积。混合均匀。
   注意：如表8所示，Cas9的添加量取决于所购买Cas9的浓度和分子量。



表8. 制备5 μM ArciTect™ Cas9核酸酶溶液


4. 将表8所示的组分在微量离心管中混合，制备出RNP复合物混合 物。根据所需的转染孔数调整组分含量。混合均匀。



表9. 准备用于化学转染的5 μM RNP复合物混合物



注意：如果在实验中使用两种或更多种gRNAs，例如使用ArciTect™ Cas9核酸内切酶，每个RNP复合物应单独制备。

注意：可能需要针对不同的细胞系进行优化。推荐Cas9与gRNA的摩尔比为1：2（表中所示）至1：4。

5. 在室温（15 - 25℃）下孵育RNP复合物混合物10分钟。当RNP复合体形成时，立即进入C部分。

C. 使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System用RNP复合物对人ES或iPS细胞进行化学转染

RNP的制备和转染应在ES/iPS铺板后约24小时应进行。

1. 为制备转染混合物，将组分在微量离心管中混合，如表10所示。根据所需的转染孔数调整组分含量。使用移液枪上下吹打混合均匀。



表10. 制备转染混合物


2. 在室温（15 - 25℃）下孵育转染混合物10分钟。
3. 取出前一天接种细胞的24孔板，吸除培养基，每孔加入450 μL 室温（15 - 25℃）预热的mTeSR™1。将板置于37℃和5％ CO₂培 养箱中。
4. 为了制备RNP转染混合物，按照表11中列出的顺序将组分在微量 离心管中混合。所示的体积用于单个孔；按需要相应的调整体 积。



表11. 准备RNP转染混合物


5. 上下吹打RNP转染混合物以混合均匀。
6. 在室温（15 - 25℃）下孵育RNP转染混合物20分钟；不要超过30分钟。
7. . 在步骤3中制备的24孔板的每个孔中滴加50 μL RNP转染混合物。轻轻地来回移动培养板2至3次，混合均匀。
8. 将培养板在37℃和5％ CO₂下孵育。
9. 每24小时完全更换培养基，加入500 μL 室温（15 - 25℃）预热的mTeSR™1。
10. 如果使用Cas9-eGFP核酸酶，可以通过流式在转染后12 - 24小时评估转染效率（参见图2）。
11. 转染后培养细胞48 - 72小时，以便基因组编辑发生。通过T7核 酸内切酶I测定评估基因组编辑效率（参见图3）。细胞可用于制备 单克隆ES或iPS细胞系，并通过T7核酸内切酶I测定和/或DNA测 序评估基因组编辑效率。有关ES或iPS细胞系亚克隆操作的说明， 请参阅CloneR™产品信息表（文档号DX21725）。