杂交瘤细胞是由分泌抗体的B细胞与适当的骨髓瘤融合株细胞融合而成。 传统方法是使用聚乙二醇（PEG）处理单细胞悬液悬浮液来实现融合。 近年来，电融合（electrofusion）作为另外一种生成杂交瘤细胞的融合技术得到了普及。 电融合可以使用更多的对照融合条件，具备更高的效率，以及融合后更好的扩增速率。 此外，它还可以使用较少的细胞数进行。 因此，当使用纯化后的B细胞或浆细胞时，电融合的优势更加明显。ClonaCell™-HY产品系列包括用于基于PEG融合的试剂，但也完全兼容使用电融合生成杂交瘤细胞。

用于电融合的仪器种类有很多。 以下流程使用的是Eppendorf® Multiporator®-少量细胞或Harvard BTX ECM2001-大量细胞进行杂交瘤细胞的电融合。 根据不同的仪器、细胞种类或融合小室（fusion chamber）的类型，融合条件可能需要进一步优化，以达到最高的融合效率。

实验材料

• ClonaCell™-HY培养基B（产品号 #03802）
• Eppendorf® Multiporator® 或 Harvard BTX ECM2001
• ClonaCell™-HY培养基C（产品号 #03803）
• T-flask（产品号 #38072）
• Centrifuge
• ClonaCell™-HY培养基D（产品号 #03804）
• 100 mm培养皿（产品号 #27125）
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• 96孔圆底板（产品号 #38018）
• ClonaCell™-HY培养基E（产品号 #03805）
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操作流程

I. 骨髓瘤细胞和脾细胞的制备

1. 从脾脏和骨髓瘤细胞中收获小鼠脾细胞，并按照ClonaCell™-HY杂交细胞试剂盒说明书的指示，用ClonaCell™-HY培养基B清洗3次。 使用ClonaCell™-HY培养基B重悬细胞，密度约为1 - 2 x 10⁶个细胞/mL。
2. 可选步骤：进行融合前，可使用EasySep™细胞分选试剂盒（表1）对B细胞或浆细胞进行富集。 使用分选富集后的细胞进行融合已被证明可以增加融合效率和抗原特异性阳性命中率（海报）。
   
   

   表1. 推荐的用于B细胞分选的EasySep™试剂盒

   产品

   产品号 #

   EasySep™小鼠Pan-B细胞分选试剂盒

   19844

   EasySep™小鼠B细胞分选试剂盒

   19854

   EasySep™小鼠CD19正选试剂盒II

   18954

   EasySep™小鼠CD138正选试剂盒

   18957

II. 电融合

1. 合并骨髓瘤和脾细胞/B细胞/浆细胞进行融合，具体如下：
   
   
   • 对于未经富集的全脾脏细胞，建议脾细胞与骨髓瘤细胞的比例为5:1。
   • 1:1 对于富集的B细胞或浆细胞，建议富集细胞与骨髓瘤细胞的比例为1:1。
2. 每次电融合所需的细胞数量：
   
   
   • Eppendorf® Multiporator®：Helix融合小室可使用50-150万个细胞
   • Harvard BTX ECM2001：多达2000万个细胞，取决于所使用的融合小室大小
3. 使用供应商提供的电融合缓冲液洗涤合并的细胞2次。
4. 按照融合小室的大小，使用适当体积的电融合缓冲液重悬清洗后的细胞。 将细胞转移至融合小室。
5. 将融合小室连接到电融合仪器中，应用表2中的推荐设置。 根据需要，可进一步优化电压和时间。
   
   

   表2. 电融合的推荐设置

   电融合仪器

   Alignment Voltage

   Alignment Time

   Fusion Pulse Voltage

   Fusion Pulse Time

   脉冲数 (n)

   Eppendorf ® Multiporator®

   6 V

   30 s

   25 V

   15 μs

   3

   Harvard BTX ECM2001

   35 V

   20 s

   3000 V

   10 μs

   1


6. 融合程序完成后，保持融合小室静置10分钟。
7. 移除融合小室，并使用ClonaCell™-HY培养基C冲洗电极芯和/或融合小室，以回收融合产物。
8. 将融合后的细胞从融合小室转移至具有ClonaCell™-HY培养基C的T-flask中。 37°C，5% CO₂，孵育16 - 24小时，确保融合的细胞在进行HAT筛选前恢复细胞活力。

III. HAT的选择和筛选

1. 过夜恢复后，离心电融合产物并重悬于ClonaCell™-HY培养基C中。
2. 转移重悬的融合产物转移到ClonaCell™-HY培养基D中，并按照ClonaCell™-HY杂交瘤试剂盒手册中的指示，在100 mm的培养皿中进行HAT筛选。
   
   a. 若使用的是未经富集的全脾脏细胞，每板接种3 - 5 x 10⁶个细胞。
   b. 若使用的是分选富集后的B细胞或浆细胞，每板接种0.5 - 1.5×10⁶个细胞。
3. 37°C，5% CO₂，在ClonaCell™-HY培养基D中培养10 - 14天，进行杂交瘤细胞的筛选。
4. 挑选在培养基D中存活的杂交瘤克隆，转移至ClonaCell™-HY培养基E中。
5. 在培养基E中扩增挑选出的杂交瘤细胞，3 - 4天后，使用ELISA、流式、western blot或其他方法进行特异性抗体检测。