肠类器官是一种生理相关性的体外细胞模型，逐渐成为探索肠上皮生物学和相关疾病研究的常用实验工具。然而类器官模型存在一些限制，例如类器官的生长需要在细胞外基质（例如Matrigel®）内进行，这会增加类器官培养以及药物筛选等应用的成本与工作量。

下文提供了将上皮类器官从Matrigel®胶滴中传代至悬浮培养的指南，有利于在获取更多的类器官的同时降低所需成本。

实验材料

• IntestiCult™ 类器官生长培养基（人）（产品号 #06010）
• 含25% BSA的PBS
• 含15 mM HEPES的DMEM/F-12（产品号 #36254）
• Corning® Matrigel® 基质，GFR，不含酚红
• 用于悬浮培养的超低粘附板（产品号 #38071）
• Y-27632（产品号 #72302）
• D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）（产品号 #37350）
• 温和细胞解离试剂GCDR（产品号 #07174）
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• 移液器（产品号 #38060）
• 移液器吸头（产品号 #38034）
• 一次性移液管（产品号 #38004）
• 15 mL离心管（产品号 #38009）
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实验步骤

1. 根据IntestiCult™ 类器官生长培养基（人）产品说明，从每孔含50 µL 50% Matrigel®胶滴的24孔板中获取类器官培养物
   *6孔规格的悬浮培养板的1个单独孔需要4-6个来自24孔板的单独孔（即600-1000 个类器官）
2. 按照产品说明制备IntestiCult™ 类器官生长培养基并恢复至室温（15 - 25°C）
   *6孔悬浮培养板的单个孔需要3 mL培养基
3. 每孔添加3 mL IntestiCult™ 类器官生长培养基，并置于37°C孵育至少1小时
4. 冰上解冻Corning® Matrigel®。每孔需要500 µL Matrigel®。将含有15 mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上
5. 小心吸去培养基，不要碰触Matrigel®胶滴
6. 添加1 mL细胞解离试剂（GCDR）至胶滴顶端，室温孵育1分钟
7. 使用GCDR预湿1 mL移液器吸头，随后使用此吸头将Matrigel®胶滴彻底刮离孔底。在孔中上下吹打2-3 次以分离胶滴和类器官。避免用移液器吸头接触孔底部，并确保孔板中没有Matrigel®碎片。
8. 不更换吸头，将类器官混合物转移至15 mL离心管中
9. 清洗：添加1 mL GCDR至上述孔中，并使用预先用GCDR润湿的移液器吸头上下吹打2-3 次后将孔中的液体转移到步骤8中的15 mL离心管中
10. 对每个要传代的孔重复步骤7-9
11. 将离心管在室温下置于摇床上孵育10分钟（摇床转速~40 rpm）
12. 在2-8°C下，290 x g 离心5分钟，缓慢倒出并丢弃上清液
13. 将5 mL预冷的DMEM/F-12添加至离心管中。使用预先润湿的1 mL移液器吸头上下吹打15次，以重悬并破碎类器官
    *避免用移液器吸头接触管的侧面/底部
14. 200 x g离心5分钟，吸出尽可能多的上清
15. 将每个离心管中的类器官碎片重悬于500 µL预冷的Matrigel®中。轻轻上下吹打10-15次以彻底混合（尽量避免引入气泡，且全程将Matrigel®悬浮液置于冰上。）
    *可添加10 µM Y-27632以增加类器官产量
16. 从培养箱中取出于步骤3中孵育的6孔超低粘附板，将类器官-Matrigel®悬浮液小心加至培养孔中心。Matrigel®应保持凝固并悬浮在培养基中。对每管类器官-Matrigel®悬浮液重复上述步骤即可。
17. 置于37°C，5% CO₂下孵育。培养物可维持培养长达7天。期间每2-3天进行一次半换液，操作如下：

    a. 倾斜培养板并使用移液器吸头尖端轻轻地将Matrigel®悬浮液推离至孔的远端

    b. 使用移液器轻轻吸出1.5 mL培养基，避免吸取Matrigel®悬浮液

    c. 添加1.5 mL新鲜IntestiCult™类器官生长培养基（人）

    *6孔悬浮板的每个孔应至少产生与24孔Matrigel®胶滴培养的18个孔相近数量的类器官（即1800-2400 个类器官）
18. 悬浮培养的类器官可用于下游应用，如接种至96孔板或建立单层培养物