背景

从人脐带血（CB）中分离CD34⁺细胞是造血干/祖细胞研究中非常关键的一步。但由于脐带血中CD34⁺细胞的含量较低（通常占有核细胞的0.1% - 1%）、样本血量有限且不同来源的脐带血中的细胞质量和细胞活率差异性较大，因此从脐带血获得较高纯度和高回收率的CD34⁺细胞非常关键。本篇技术公告描述了两种用于从整个CB中分离CD34⁺细胞的EasySep™ 细胞分选试剂盒，可用于包含不同量血小板的样本。

脐带血CD34⁺细胞的正选

只需要使用简单的两步法即可从整个CB分离CD34⁺细胞。首先，使用RosetteSep™人脐带血CD34预富集抗体混合物（含能结合成熟血细胞的的抗体），通过标准的密度梯度离心对CD34⁺细胞进行预富集。我们提供两种用于CD34⁺预富集的RosetteSep™抗体混合物：

• 人脐带血CD34正选试剂盒II（产品号#17896），其中包含能结合T细胞、B细胞、红细胞（RBCs)、髓系细胞和血小板的RosetteSep™抗体复合物。该抗体混合物推荐用于从包含大量血小板的CB样本中预富集CD34⁺细胞，若不去除这些血小板，可能会影响CD34⁺细胞的质量和纯度。
• 人脐带血CD34正选试剂盒III（产品号 #17897），其中包含能结合T细胞、B细胞、红细胞（RBCs)和髓系细胞的RosetteSep™抗体复合物。该抗体混合物推荐用于从包含少量血小板或无需去除血小板的CB样本中预富集CD34⁺细胞。

抗体混合物将不需要的成熟细胞与样本中的红细胞（RBCs）交联，形成免疫玫瑰花环结构（immunorosettes），接着将交联后的样本加入到标准密度梯度离心液（如：Lymphoprep™）上后进行离心（图1，步骤1-3）。从血浆和密度梯度离心液之间的界面收集预富集的CD34⁺细胞，而不需要的成熟的细胞和RBCs留在沉淀中（图1，步骤3-4）。

也可使用SepMate™管进行密度梯度离心。SepMate™管内置独特的插件，可防止密度梯度离 心液和血液样本发生混合。首先使用移液管从插件中央的小孔加入密度梯度离心液，再将样本倾倒或快速移液至插件上方，免去了将样本沿管壁小心地加至密度梯度离心液之上这一费时费力的步骤。离心仅需10分钟，且该步骤中可开启离心机刹车，进一步减少了分选需要的时间。离心后，富集的CD34⁺细胞可被轻松地倾倒至一个新的试管中。

然后，预富集的CD34⁺细胞通过孵育被EasySep™ 分选抗体混合物和EasySep™ Dextran RapidSpheres™磁珠（图1，步骤5-6）标记。接着，将含有被免疫磁珠标记的细胞悬液的试管放入合适的EasySep™磁极中，经过短暂的孵育后，非目的细胞被简单倾倒出，而目的CD34⁺细胞被保留在试管内（图1，步骤7-8）。分离所得的CD34⁺细胞可立即用于下游应用。

去除血细胞

使用EasySep™分离CD34⁺之前，在RosetteSep™预富集过程中去除血小板，与传统的离心方法相比，可提高纯化细胞的回收率。然而，在某些情况下，并不需要去除血小板。

• 试剂盒II（产品号 #17896）中的RosetteSep™抗体混合物通过标记血小板在预富集步骤中将其去除。该试剂盒推荐用于采集后放置超过24小时且有一定量血小板活化或聚集的样本。图2和表1中展示了试剂盒II的相关实验结果（第3页）。
• 试剂盒III（产品号 #17897）中的RosetteSep™抗体混合物不标记血小板，推荐用于新鲜的CB样本（采集后放置小于24h），含有非常少量血小板的样本和不需要去除血小板的样本。图3和表2中展示了试剂盒III的相关实验结果（第3页）。

CD34⁺细胞预富集和正选的常规操作步骤

实验数据

人脐带血CD34正选试剂盒II

人脐带血CD34正选试剂盒III

产品信息

其他材料*

• 50 mL锥形管，如：SepMate™-50（产品号 #15450）
• 5 mL或14 mL聚苯乙烯圆底管
• EasySep™缓冲液（产品号 #20144），RoboSep™缓冲液（产品号 # 20104）；或者含2%胎牛血清（FBS）和1 mM EDTA的PBS
• 密度梯度离心液，如：Lymphoprep™（产品号 #07801)）
• EasySep™磁极（产品号 #18000/18001/18103）或 RoboSep™全自动细胞分选仪（产品号 #21000/23000）

其他用于分离人CD34⁺细胞的试剂盒

• 从只需去除粒细胞和RBC的整个CB样本中分离CD34⁺细胞，推荐使用EasySep™人脐带血CD34正选试剂盒II（产品号 #17896）
• 从新鲜外周血或白膜层分离CD34⁺细胞，推荐使用人全血CD34+细胞完全试剂盒（产品号 #15086）。
• 从其他样本分离CD34+细胞，包括新鲜或冻存的动员外周血、骨髓单个核细胞、冻存的脐带血来源的单个核细胞，推荐使用EasySep™人CD34+正选试剂盒II（产品号 #17856）。

CD34⁺细胞的培养

分选后，可使用专门的细胞培养基（如含有细胞因子或其它添加物的StemSpan™无血清培养基）培养CD34 ⁺细胞。StemSpan™扩增添加物中优化了细胞因子和添加物的配比，以促进HSPCs的扩增或它们的谱系特异性分化，从而生成大量成熟的红系细胞，巨核细胞或髓系细胞，其具体取决于所用的添加物种类。纯化的CD34 ⁺细胞也可以使用基于甲基纤维素的MethoCult™培养基进行集落形成单位（CFU）检测，或使用MyeloCult™培养基进行LTC-IC分析。