对肝类器官进行悬浮培养可以显著提高培养的规模。与在Matrigel®胶滴中生长的类器官相比，在稀释的Matrigel®悬浮液（Dilute Matrigel® suspension）中生长的类器官不仅支持在更大的生物反应器中培养 (例如：旋转烧瓶），而且通常能够更早地进行传代（在稀释的Matrigel®悬浮液中培养4 - 7天后即可传代，而使用Matrigel®胶滴则需要7 - 10天）。

下面我们将详细阐述如何使用HepatiCult™类器官生长培养基 (人) 通过稀释的Matrigel®悬浮培养扩增肝类器官。

一、实验材料：

• 在HepatiCult™类器官生长培养基 (人)中培养的健康肝类器官
• HepatiCult™类器官生长培养基 (人)（产品号 #100-0385)
• DMEM/F-12 + 15 mM HEPES (产品号 #36254)
• 25% BSA
• Corning® Matrigel® (Corning 356231，≥8 mg/mL蛋白)
• 抗生素 (如庆大霉素)
• 115 mL锥形管 (产品号 #38009)
• 用于悬浮培养的超低吸附（ULA）6孔板（Catalog #100-0083)或100 mL无菌旋转烧瓶
• 无菌的200 µL和1000 µL枪头
• 5 mL和10 mL血清移液管 (产品号 #38003，产品号 #38004)
• 泡沫冰盒
• 细胞培养箱
• 可放置在培养箱中的轨道摇床或兼容旋转烧瓶的搅拌平台

二、准备工作：

1. 将Matrigel®解冻并放置在冰上。
2. 在2-8°C下过夜解冻HepatiCult™类器官生长添加物，使用无菌技术在冰上制备100mL添加有Matrigel®的HepatiCult™类器官生长培养基 (OGM):
   • 90 mL HepatiCult™类器官生长培养基
   • 5 mL Hepaticult™类器官生长添加物
   • 5 mL Matrigel®基质胶
   • 添加抗生素（如：50 µg/mL 庆大霉素）
   • 充分混匀，置于冰上

   注意：HepatiCult™类器官生长添加物解冻后请立即使用或者分装后存储在-20°C。分装后一旦解冻，请立即使用不要反复冻融。每次使用前制备新鲜的OGM + Matrigel®，请勿长期存储剩余的部分。

3. 制备50 mL添加血清的DMEM/F-12 + 15 mM HEPES (DMEM + BSA):
   • 2 mL 25% BSA (最终浓度为1%)
   • 47.9 mL DMEM/F-12+15 mM HEPES
   • 充分混匀，置于冰上
4. 如果使用ULA 6孔板，将培养板放置在2 - 8 °C下至少10分钟。如果使用旋转烧瓶，请在使用前将烧瓶置于冰上至少10分钟。

操作步骤：

1. 根据所使用的培养方案进行肝类器官培养，如下所示:
   如果对6孔板悬浮培养的肝类器官传代:

   • 使用血清移液管，将所有要传代的肝类器官移液至15 mL锥形管中。将试管在室温下放置 5 - 10 分钟，使类器官沉淀。
   • 尽可能多地吸取上层培养基，小心不要吸取到肝类器官，在试管中留下最多0.5 mL培养基。
   • 将1 mL预冷的DMEM + BSA添加到试管中。
   如果对Matrigel®胶滴中的肝类器官传代：

   • 检查Matrigel®胶滴是否完好(即整个胶滴仍然附着在培养板上，并且孔中没有观察到松散的Matrigel®碎片或类器官)。如果胶滴完好无损，继续执行下一步。如果胶滴松散，添加预冷的DMEM + BSA将培养孔中的总体积加至1mL，并静置1分钟，然后跳过下一步而不吸出培养孔中的培养基。
   • 在不触碰到胶滴的情况下，吸出培养孔中的培养基。
   • 使用1 mL移液器，用力将1 mL预冷的DMEM + BSA添加到每个胶滴的中心，静置1分钟。
2. 使用移液器上的1mL枪头，用力上下吹打45次，注意不要产生气泡。

   注意: 这会导致肝类器官和Matrigel®被机械解离成大小在 30 - 100 μm之间的碎片。如果仍然有许多较大的碎片，请继续吹打，直到大多数碎片的尺寸小于100 μm。

   注意: 如果需要，可以使用细胞过滤器来收集尺寸更均匀的碎片。

3. 根据后续传代所需要的碎片数量确定移液体积，并转到含有1 mL DMEM + BSA的15 mL锥形管中。

   注意: 应针对供体样本状态优化接种密度。建议每mL OGM + Matrigel® 使用约1000 - 3000个碎片。

4. 将锥形管以290xg离心5分钟。
5. 在不碰到沉淀的情况下尽可能多地吸出上清液（沉淀通常肉眼不可见）。
6. 重悬沉淀并将试管放置在冰上，如下所述：
   • 如果使用6孔板，则每孔加入0.5 mL OGM + Matrigel®。
   • 如果使用旋转烧瓶，则加入3 mL OGM + Marigel®。
7. 将预冷的6孔板或旋转烧瓶放置于生物安全柜的冰上。在6孔板中加入1.5 mL预冷的OGM + Matrigel®，或在旋转烧瓶中添加47 mL预冷的OGM + Matrigel®。
8. 将步骤6中的OGM + Matrigel® +类器官碎片混合液加入到培养容器中，并旋转容器以混合均匀。
9. 小心地将培养板或烧瓶分别转移到设置为80 rpm的轨道摇床或设置为33 rpm的搅拌平台上，并置于37°C和5% CO₂的培养箱中。
10. 每2 - 3天进行一次全培养基更换，步骤如下:
    • 将培养容器倾斜约45度角，让肝类器官沉淀3 - 5分钟。如果使用旋转培养瓶，请小心不要碰到中心臂，因为这会搅拌肝类器官从而使其变回悬浮液。
    • 吸出约75%的上层培养基，注意不要吸出任何类器官。
    • 添加等体积的新鲜并处于室温的完全HepatiCult™ OGM培养基。

    注意: OGM不需要再添加Matrigel®。为了避免在周末更换培养基，请在周一、周三和周五进行换液。肝类器官应在管腔变暗和塌陷前进行传代，大约每4 - 7天传代一次。

以上便是使用HepatiCult™类器官生长培养基（人）在稀释的Matrigel®中悬浮培养扩增肝类器官的详细步骤，希望对您的研究有所帮助。