以下是使用HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）（产品号#06030）培养肝类器官的实验流程的补充说明。有关完整的培养方法，请将该文档与产品说明书（PIS；文档号 DX21821）配合使用，其中包括完整的材料清单和分步说明，用于从小鼠肝组织中分离出肝导管片段，如何通过Corning®Matrigel® dome（凝固液滴）培养肝祖细胞类器官，以及如何对类器官进行团块传代。

下表概述了在HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中培养肝祖细胞类器官的可用方案，以及对应的详细方案。在此表中，Tech Bul. 请参阅本文档（DX27087），而PIS请参见产品说明书（DX21821）。

1 肝类器官培养的通用流程

1.1 预先湿润培养器皿

与肝管接触的锥形离心管（下文中简称“离心管”）和血清移液管应预先润湿，因为肝管经常粘附在其表面上，从而大大降低了类器官的回收。实验当天将离心管和移液管预先湿润。

对15 mL离心管进行预湿润：首先向该管添加5 mL Anti-Adherence Rinsing Solution（产品号 #07010），摇晃以彻底润洗。将Rinsing Solution倒入下一离心管，重复进行，直到所有离心管都被预先湿润。用相同体积的Advanced DMEM/F-12（Thermo Fisher #12634010）重复这些润洗步骤。对50 mL离心管进行预湿润：使用以上步骤，更改溶液为30 mL。预湿润后的离心管，将盖子拧紧，可在室温（15-25°C）下保存直至使用。对移液管和枪头进行预湿润：首先在一个15 mL离心管中加入10 mL Anti-Adherence Rinsing Solution，并在第二个15 mL管中添加10 mL Advanced DMEM/F-12。使用移液管或枪头前，依次用两种溶液润洗。

1.2 推荐的接种密度

为了获得最佳结果，从一个肝脏（参见PIS）收集的肝管小段接种到4个孔中（每孔一个30 μL Matrigel® dome），若按照单细胞接种的方式，则接种至8个孔中（参照2.1部分）。类器官体系建立后（p1以后），每30 μL Matrigel® dome中接种200个类器官片段（PIS Section B）或10,000 - 15,000单个细胞（下文第2.2节）。

重要的是不要接种过多类器官培养物。如果Matrigel® dome中接种了太多的起始细胞，类器官将无法正常生长，并且会损害基质的结构稳定性。

1.3 肝祖细胞类器官的传代时间

原代培养体系（p0）建构的类器官，每4-7天即可进行传代，经一次传代后（p1+），一般3-5天需要进行一次传代。传代的最佳时间为类器官内腔开始变暗，不同的培养体系传代时间可能会有所差别，也会因接种的起始密度和组织来源而不同。如果大部分的类器官中心腔清晰、小于100 μm，则将培养物放回培养箱中再培养一天。

如果大部分的类器官中心腔变暗或开始塌陷（图1C和2C），仍然有机会通过传代使培养物恢复。在进行传代时，只对类器官片段进行计数，不计入单个细胞（图3），每孔接种200个类器官片段。发暗及塌陷的类器官培养物也可能通过单细胞传代（下文第2.2节）恢复，由于单细胞传代可以选择性扩增健康的干细胞群。

类器官培养物也可能表现出不同的形态，其中存在大量小而致密且变暗的类器官，这些不是健康的类器官塌陷的结果，而是这些类器官无法变大。这种情况可以通过传代改善。改善这种情况的做法是对培养物进行机械研磨，接种前使用70μm的细胞筛网过滤。小而致密的类器官在研磨过程中不会破裂，被筛网阻隔而被去除，健康的类器官片段则通过筛网在滤液中得到富集。对过滤后的滤液组分进行计数，接着每孔接种200个类器官的片段。

1.4 机械研磨和收集类器官片段

扩增后的类器官在传代过程中被机械研磨，得到小于100 μm的类器官片段（图3A）。如果大部分片段大于100 μm（图3B），在收集类器官片段前继续进行研磨。当进行类器官片段计数时，仅对小于100 μm的片段计数，不计入单个细胞（图3C）。

2 将肝管和类器官解离为单个细胞

2.1 将原代肝组织解离为单个细胞

1. 配置完全的HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）；请参阅PIS。当类器官起始样本来自于单个细胞时，或以单个细胞进行类器官传代是，添加Y-27632（产品号 #72302）至完全HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中至终浓度为10 μM。
2. 配置DNase I + TrypLE™溶液：将50 μL的1 mg / mL DNase I Solution（产品号 #07469）加入5 mL的TrypLE™Express Enzyme（Thermo Fisher #12605010）中，混合均匀，置于冰上。
3. 按照PIS的步骤A.1-19中所述，处理单个小鼠肝脏以收获肝管时。跳过步骤A.17，以收集尽可能多的组织，然后按照步骤A.18-19，在37 μm Reversible Strainer（产品号 #27250）上收集肝管，并洗脱到经Advanced DMEM/F-12预湿润的的50 mL离心管中。
4. 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在管中留下约5-10 μL液体。
5. 使用预先湿润的10 mL移液管，向沉淀中加入4 mL DNase I + TrypLE™溶液。通过轻轻上下吹打5-10次来重悬沉淀。放置在37°C水浴中10分钟，以将收集到的肝管解离成单个细胞。
6. 加入8 mL Advanced DMEM/F-12。使用预先湿润的37 μm细胞筛网过滤，过滤后的细胞悬液。
7. 收集的细胞悬液以290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在管中留下约5-10 μL液体。
8. 将沉淀重悬于1 mL Advanced DMEM/F-12中。
9. 加入4 mL冷氯化铵溶液（产品号 #07800）以溶解红细胞。轻轻地上下吹打5至10次，混合均匀。将等体积的该悬浮液转移到8个预先湿润的15 mL锥形管中。将锥形管在冰上放置5分钟以裂解红细胞。
10. 以290 x g，对8个离心管离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在管中留下约5-10 μL液体。置于冰上。
11. 根据PIS的步骤A.22-31将细胞接种到8个孔中，在Matrigel® domes中培养；或者按照步骤3.1.6-3.1.15的步骤使用Dilute Matrigel® suspension方法进行培养（如下）。

2.2 将在Matrigel® Domes中培养的肝祖细胞类器官解离为单个细胞

1. 按照PIS的步骤B.1 - 8处理Matrigel® domes。
2. 将收集好的肝祖细胞类器官片段的离心管于290 x g离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在管中留下约5-10 μL液体。置于冰上。
3. 加入1 mL DNase I + TrypLE™（制备步骤参上面2.1.2部分），轻轻上下吹打5 - 10次。移液枪仅推至一档，避免引入气泡。放置在37°C水浴中10分钟，以将收集到的类器官片段解离成单个细胞。
4. 加入2 mL Advanced DMEM/F-12。
5. 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在管中留下约5-10 μL液体。
6. 加入1 mL冷的Advanced DMEM/F-12重悬沉淀。使用细胞计数板进行细胞计数。
7. 由于每孔需接种10,000-15,000个细胞，将对应数量的细胞加入相应的15 mL离心管中，每管预先加入1 mL冷的Advanced DMEM/F-12。小心分装细胞，注意不要过量接种细胞（参见上面的1.2节）。
8. 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀，在管中留下约5-10 μL液体。置于冰上。
   
   注意：沉淀通常很难看到。
9. 接下来的传代流程请参考PIS的步骤A.22 - 31。

3 对使用Dilute Matrigel® Suspension方法培养的肝祖细胞类器官的构建和传代

除了在Matrigel® dome中培养外，还可以在稀释的Matrigel®悬浮液（dilute Matrigel® suspension）中培养肝祖细胞类器官。当悬浮培养时，Matrigel®会形成半固态的“云”状体，松散地包裹正在生长的类器官。悬浮培养方法使培养的规模得以扩大，超出了在Matrigel® dome中进行接种的实验通量。扩大的原因是由于减少了培养基换液的步骤，减少了对Matrigel®物理稳定性的依赖，以及使用了更适合于高通量的实验流程。与在Matrigel® domes中生长的类器官相比，在dilute Matrigel® suspension中生长的类器官通常可以更早地传代，通常在3-6天之内即可进行传代，也可以对培养物进行冻存，留待后续实验使用。

3.1 使用Dilute Matrigel® Suspension方法构建类器官培养物

1. 将包装好的用于悬浮培养的12孔板（Greiner Bio-One #665102）置于2 - 8°C至少10分钟。将无菌的1000 μL和200 μL枪头置于2 - 8°C。
2. 冰上解冻500 - 1000 μL Matrigel®。
3. 配置完全的HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠），置于冰上，配置流程请参阅PIS。
4. 准备组织解离试剂（参见PIS）。预热至室温（15 - 25°C）。
5. 处理小鼠肝脏组织，按照PIS步骤中的A.4 - 21收集肝管片段。或者按照上述2.1节的流程将原代肝脏组织解离为单细胞。
6. 使用预冷的枪头，在15 mL离心管中加入100 μL解冻的Matrigel®至900 μL预冷的HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠）中（用量举例：如果要接种10个孔，则该管应装有1 mL Matrigel®与9 mL冷的HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠））。混合均匀，置于冰上。
7. 将预冷的12孔版置于冰上，每孔加入上一步骤配置的950 μL Matrigel®/HepatiCult™混合物。
8. 将PIS步骤中的A.21样本，按照下述描述的步骤，每次处理一管/沉淀。将Matrigel®加入沉淀的细胞后动作一定要迅速，防止Matrigel®固化。
9. 使用预冷的200 μL枪头，每管加入50 μL Matrigel®/HepatiCult™混合物（3.1.6中制备）。
10. 轻轻上下吹打5 - 8次，混合均匀。移液枪仅推至一档，避免引入气泡。
11. 将全部混悬液加入含有950 μL Matrigel®/HepatiCult™混合物的12孔板中（3.1.7中制备）。轻柔晃动培养板，混合培养物。
12. 重复3.1.9 - 11步，接种所有的样本。
13. 盖上盖子，将培养板置于37°C度培养箱的定轨摇床上，转速为80 rpm，5% CO₂培养。
14. 接种10分钟后，使用明场显微镜对每孔进行2X拍照（第0天图像）。将培养板放回培养箱。
    
    注意：一旦培养物在37°C的定轨摇床进行培养，每孔中的Matrigel®会形成半固态的“云”状体，松散地包裹正在生长的类器官。
15. 每天对每孔进行拍照，或者在设计好的时间点进行拍照，以追踪类器官的生长直到传代。无需进行培养基换液。

3.2 对使用Dilute Matrigel® Suspension培养的肝祖细胞类器官进行传代

1. 将包装好的用于悬浮培养的12孔板（Greiner Bio-One #665102）置于2 - 8°C至少10分钟。将无菌的1000 μL和200 μL枪头置于2 - 8°C。
2. 冰上解冻500 - 1000 μL Matrigel®（每孔需要约110 μL）。
3. 配置完全的HepatiCult™类器官生长培养基（小鼠），置于冰上，配置流程请参阅PIS。
4. 使用一个1000 μL的枪头估计每孔大概含有多少体积的培养物。将移液枪设置为该体积，上下剧烈吹打30次。移液枪仅推至一档，避免引入气泡。
   
   注意：此步骤旨在对肝祖细胞类器官进行机械解离，将其解离为30 - 100 μm大小的类器官片段。镜下观察片段大小是否合适，如大部分类器官片段仍旧大于100 μm，对其继续进行机械研磨至片段小于100 μm（参见上文1.4节）。
5. 如果对多孔进行传代，将所有孔收集的细胞合并到一个15 mL离心管中。如果仅对一个孔进行传代，将该孔收集到的所有细胞收集到一个15 mL离心管中。
6. 若对类器官进行片段方式接种，请参考PIS步骤中的B.9 - 11。如以单个细胞进行接种，请参考下述步骤2.2.2 - 2.2.8。
7. 传代过程中的剩余步骤，请参考上面所述的3.1.6 - 3.1.15节。
   
   注意：每天都对肝祖细胞类器官进行观察。200个类器官片段接种的培养物通常每3 - 6天需进行传代；第一次传代后，后续的传代比例通常在1:10到1:30间。

4 对肝祖细胞类器官进行冻存

1. 将预冷的Advanced DMEM/F-12和CryoStor® CS10（产品号 #07930）放于冰上，置于生物安全柜中。
2. 将1.8 mL的细胞冻存管准备好。使用前，将细胞冻存管置于生物安全柜中的冰盒上。
3. 准备类器官片段进行冻存，参考PIS步骤中的B.4 - 10。使用PIS步骤中B.10描述的计算方法，计算每800个类器官片段所需的培养物体积（总体积为 800个类器官片段 x 冻存管数量，每个冻存管冻存800个类器官片段）。将该体积转移至含有1 mL Advanced DMEM / F-12的15 mL离心管中。
4. 290 x g，离心5分钟。吸出尽可能多的上清液，不要干扰沉淀（沉淀通常很难看到），在管中留下约5-10 μL液体。置于冰上。
5. 打开1.8 mL的细胞冻存管，保持在冰上操作，减少操作时间。
6. 使用1 mL预冷的CryoStor® CS10将沉淀的细胞重悬均匀，上下轻柔的吹打5 - 8次。
7. 在每个细胞冻存管中加入1 mL预冷的CryoStor® CS10。对混合物再轻柔的上下吹打5 - 8次。
8. 使用1000 μL的枪头，将1 mLCryoStor®/类器官片段的混合物均分至标记好、且预冷的1.8 mL细胞冻存管中。在将混合物分装至细胞冻存管前，上下轻柔的吹打混合物1 - 2次，确保类器官片段分散均匀。
9. 马上拧紧盖子，将保存有类器官样品的细胞冻存管放于逐级降温的细胞冻存盒中。将细胞冻存盒放于-80°C。
10. 冻存的类器官应于在-80°C保存24 - 48小时后，转移至液氮中。
    
    注意：想要获得完整的复苏流程，请参考小鼠肝祖细胞类器官的PIS（文档号 #DX22147）。