下面的实验流程适用于从乳腺癌（4T1）、黑色素瘤（B16-F10）和结肠癌（CT26.WT）的小鼠模型的实体瘤组织中生成单细胞悬液，但也可能适用于其他组织类型。得到的单细胞悬浮液可用于各种下游应用，如使用EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒分离肿瘤浸润白细胞（TILs）。

Materials

• 胶原蛋白酶/透明质酸酶（产品号 #07912）
• DNase I溶液（1 mg/mL，产品号 #07900）
• RPMI 1640培养基（产品号 #36750）
• 35 mm培养皿（如产品号 #38069）
• 刀片、手术刀或剪刀
• 14 mL圆底管（如Falcon®圆底管，产品号 #38008）
• 70 μm细胞筛网（如产品号 #27260）
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• 50 mL离心管（如Falcon®锥形管，产品号 #38010)
• 氯化铵溶液（如产品号 #07800)
• 移液枪（如Corning® Lambda™ Plus Pipettor，产品号 #38060)
• 枪头（如Corning® Filtered Pipette Tips，产品号 #38034)
• 血清学移液管移液器
• 血清学移液管（如Falcon® Serological Pipettes，10 mL，产品号 #38004)
• 推荐使用的悬浮液（可能因下游应用而不同）*
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操作流程

以下说明是针对处理≤1g的肿瘤组织。对于>1g的肿瘤组织，相应地调整体积。

1. 准备5 mL的肿瘤消化液，混合以下溶液。
   • 500 μL 胶原蛋白酶/透明质酸酶
   • 50 μL DNase I溶液（1 mg/mL）
   • 3.75 mL RPMI 1640培养基
   充分混合，预热至室温（15 - 25°C）。
2. 在培养皿中处理肿瘤组织。
3. 用刀片、手术刀或剪刀将肿瘤组织切成小块（≤2 mm）。
4. 将切碎的肿瘤组织转移到含有肿瘤消化液（步骤1中准备）的14 mm圆底管中。
5. 在摇床上，37°C孵育25分钟。
6. 在50 mL锥形管上放置一个70 μm的细胞筛网，用推荐的培养基*进行冲洗。将消化后的肿瘤组织转移到细胞筛网中。使用注射器活塞的橡胶端，将消化后的肿瘤组织推过过滤网。用推荐使用的悬浮液*冲洗滤网，并将试管加满至50 mL。
7. 300 x g，室温离心10分钟，调低离心刹车。小心的移除上清。
8. 在细胞沉淀中加入10 mL氯化铵溶液。室温中孵育1-2分钟。
9. 用推荐使用的悬浮液*将其加到50mL。300 x g，室温离心10分钟，调低离心刹车。小心的移除上清。在推荐的培养基中以5 x 10^7个细胞/mL重悬细胞。

注： 如需提高TIL纯度，以5 - 10 x 10^7细胞/mL重悬细胞；如需提高TIL回收率，以1 - 2.5 x 10^7细胞/mL重悬细胞。

*推荐使用的悬浮液可能因下游应用而异。使用EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒进行细胞分选时，推荐使用EasySep™ Buffer（产品号 #20144）或含有2% FBS和1 mM EDTA的PBS（如产品号 #37350）作为悬浮液。细胞悬浮液应不含Ca++和Mg++。