过继性T细胞治疗（adoptive T-cell therapy, ACT）是一个快速增长的研究领域。若想最大化激发患者来源T细胞的治疗潜能，对大量制造T细胞的方案进行优化是非常重要的。单次过继性T细胞治疗需要数十亿个扩增的T细胞。大规模生产可用于细胞治疗的T细胞是一个极其复杂的过程，其操作过程中的诸多步骤亟待优化，以达到细胞产量最大化，同时维持所需表型及功能的目的。在本篇技术公告中，我们阐明了细胞密度对T细胞扩增的重要性。我们的研究结果表明，将T细胞维持在较低的密度可以改善T细胞的生长和活率，特别是在细胞扩增的早期阶段。通过优化培养方案，在静态培养下，可在10-14天内实现高达800倍的人T细胞扩增，且细胞活率>85%。该培养方案同时适用于Xuri™细胞扩增系统W25（GE Healthcare）并促进整体细胞增长。该技术公告中的操作可轻松适用于T细胞扩增流程，以确保最佳细胞活率和总扩增量。

为了研究早期细胞稀释对于T细胞扩增的影响，向添加有rhIL-2的ImmunoCult™ -XF T细胞扩增培养基中加入ImmunoCult™人T细胞激活剂 in ImmunoCult™-XF T Cell Expansion Medium，并以浓度为1×10⁶个/mL接种T细胞。第3天时，通过继续添加含有rhIL-2的ImmunoCult™ -XF T细胞扩增培养基，将T细胞的培养体积扩大2倍、4倍、8倍、16倍或32倍。在第5和第7天时，T细胞培养体积继续扩大4倍。如图所示，在第5天时，将T细胞转移到2L Xuri™ Cellbag™生物反应器并维持在Xuri™细胞扩增系统W25中。在10或11天收集T细胞进行分析。

结果

早期细胞稀释对人T细胞扩增的影响

为了研究细胞密度对人T细胞扩增的影响，我们使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂或ImmunoCult™人CD3/28 T细胞激活剂在第0天激活T细胞。在第3天，我们将总培养体积扩大2倍、4倍、8倍、16倍或32倍，并确定不同培养体积对细胞总扩增量的影响。其中，在扩大4倍和8倍培养体积条件下的细胞扩增量和细胞活率最高，并且经扩增细胞的活化表型没有显著变化（图2）。

T细胞激活剂的对比

在使用ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂的情况下，8倍培养体积的细胞扩增量明显高于4倍培养体积的扩增量（图3A）。相反，在使用ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂时，8倍培养体积和4倍培养体积的细胞扩增量并未出现显著性差异（图3B）。

推荐人T细胞扩增流程

根据上述实验结果，我们可以通过改变细胞稀释浓度来优化人T细胞扩增流程（图3C）。最佳细胞稀释浓度为在细胞活化后的第3天，将培养体积扩大8倍，或将细胞密度维持在1 - 2.5×10⁵个/mL。我们在细胞活化后的第5和第7天，分别将培养体积继续扩大4倍以进一步稀释扩增的细胞。

使用Xuri™细胞扩增系统进行人T细胞扩增

细胞治疗往往需要获得数十亿T细胞，且需要在可控环境中对细胞进行大量扩增。上述T细胞优化扩增流程可以适用于Xuri™细胞扩增系统W25，以在封闭系统中扩增出用于细胞治疗的T细胞。

如图1所示，将T细胞接种于培养瓶中。第3天时，加入新鲜培养基将培养体积扩大2倍、4倍或8倍，然后在第5天时将细胞转移到Xuri™ Cellbag™ 生物反应器。结果表明在培养第3天将培养体积扩大8倍可以获得最高的扩增倍数（图4）。

扩增的T细胞的表型

除细胞数外，T细胞表型在细胞治疗的功效中起到至关重要的作用。例如，小鼠实验模型研究表明，与高度分化的T细胞亚群相比，低度分化的T细胞（初始T细胞、干细胞样记忆性T细胞、或中枢记忆性T细胞）表现出更优异的抗肿瘤活性¹。

使用ImmunoCult™试剂进行静态培养或在Xuri™细胞扩增系统中扩增的大部分T细胞共表达CD62L和CD45RO，表明其具有中枢记忆性T细胞的表型（图5）。

讨论

T细胞扩增流程的优化对于细胞治疗来说意义重大。在本篇技术公告中，我们阐明了T细胞活化后，细胞密度对于优化T细胞扩增的重要性。

我们发现在T细胞扩增早期维持较低的细胞浓度可有效促进T细胞生长并提高其活率。我们同时发现，在优化T细胞扩增流程时，第3天是调整细胞培养体积的关键时间点。在细胞活化后的第3天，培养的T细胞高表达CD25和PD-1，显示出高激活水平，但还没有明显的扩增（图2）。我们推测在这个时间点可以通过降低细胞密度的方式，来增加细胞可用营养物质和每个细胞接受到活化信号后的生存空间，从而促进T细胞扩增。另一方面，过低的细胞密度可能导致细胞自分泌存活因子浓度的降低或细胞间接触机会的减少，这两点都是支持最佳细胞扩增和活率的关键因素。

在实验过程中，当研究人员优化细胞扩增方案时，需要考虑到的一个变量是基因修饰。用于治疗的T细胞往往需要进行基因修饰，其方法包括使用病毒载体²和基因编辑核酸酶³。这两种方法会对最佳培养稀释度产生何种影响仍有待研究。

这篇技术公告为检测其它变量对T细胞扩增的影响提供了一个基本思路框架。这些变量包括起始细胞群（T细胞亚群）、细胞因子、或生长因子，它们都会对最佳培养体积的扩大产生影响。因此我们建议研究人员根据自己的实验流程对最佳培养体积进行探索。最后，使用经过充分验证且完全优化的方案有助于解决T细胞治疗过程中遇到的障碍，比如缺乏标准化流程。

优化的T细胞激活和扩增试剂

这篇技术公告中用到的T细胞激活和扩增试剂是我们与GE Healthcare合作的一部分，我们的合作旨在开发和生产用于T细胞治疗的试剂。我们希望此次合作和开发的试剂有助于将T细胞治疗从实验室推广到临床。了解更多：