EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
分选前进行淋巴细胞的预富集可提高分选效率
分选前进行淋巴细胞的预富集可提高分选效率
- Document # 27137
- Version 2.0.0
- 5/21/21
仅通过流式细胞分选技术分离稀有细胞类型可能会非常耗时，特别是在处理大体积样本或稀有细胞类型时。在分选前预富集细胞群，比仅使用流式细胞分选（FACS）能更快地获得稀有细胞，从而节省时间和成本。
通过去除不需要的细胞可以快速实现目的细胞的预富集。例如，可以使用免疫磁珠细胞分选技术预先富集细胞，然后再通过流式细胞分选获得最终的目的细胞。
本技术公告将以分离先天性淋巴细胞（ILCs）为例，阐述在处理复杂以及稀有细胞类型时，如何在流式分选之前进行预富集以显著减少分选时间并提高目的细胞纯度。
背景介绍
先天性淋巴细胞（ILCs）是先天免疫的重要效应细胞，在免疫调节、炎症和维持体内稳态等方面具有重要作用。在健康个体中，ILCs的含量非常少，其在小鼠和人外周血的CD45+白细胞中所占比例小于0.1%1,2。ILCs的低含量和缺乏特定的表面标记物给其分离和鉴定带来了挑战。目前普遍使用多色流式细胞仪分离ILCs，然而这种分选方法耗时久、价格昂贵并且分离得到的细胞回收率低。本文描述的细胞分选方法可大大减少分离ILC所有类型（ILC1、ILC2和ILC3）所需的时间。
实验方法
用含2%胎牛血清（FBS）的PBS洗涤未处理的白细胞单采样本两次，以制备单细胞悬液。方法一，用荧光标记抗体对单细胞悬液进行染色后，直接通过流式细胞仪分选ILCs。方法二，在抗体染色并进行流式分选之前，使用EasySep™人Pan-ILC富集试剂盒（产品号 #17975）预先富集目的细胞。简言之，使用免疫磁珠负选预富集ILCs，其中非目的细胞被抗体复合物和磁珠结合并去除。比较两种分离方法的细胞纯度、回收率和操作时间。
实验结果
为了评估EasySep™预富集对ILC分选的影响，用荧光标记抗体对未富集和EasySep™富集的样本进行染色，接着使用以下标志物对ILCs进行流式检测：CD45+、谱系阴性（CD1a、CD3、CD11c、CD14、CD19、CD34、CD123、TCRαβ、TCRγδ、BDCA-2、FcεR1α、CD94、CD4、CD16）和CD127+。再进一步通过CRTH2和CD117的表达来定义ILC1、ILC2和ILC3亚群。如图1所示，EasySep™试剂盒显著提高了流式分选前ILCs的纯度。
图1. 通过EasySep™预富集提高了流式分选前的ILCs起始纯度
（A）起始样本为新鲜的白细胞单采样本，对未进行预富集的样本和经EasySep™预富集的样本染色，并以白细胞、活细胞、CD45+、Lin-和CD127+设门。根据CRTH2和CD117的表达鉴别ILC1、ILC2和ILC3亚群。以上图示为具有代表性的流式检测图。（B）未进行预富集的样本和经EasySep™预富集的样本中CD45+细胞（ILCs）的纯度分别为0.07%和53.6%（未预富集n=20，EasySep™预富集n=22；数据表示平均值±标准偏差）。
为了评估从未进行预富集的样本和经EasySep™预富集的样本中分离ILCs的效率，对流式分选的时间和ILCs的细胞纯度进行了比较（图2）。
图2. 通过EasySep™预富集显著减少获得最终ILCs所需的时间
起始样本为新鲜的白细胞单采样本，同时从未进行预富集的样本和经EasySep™预富集的样本分离ILCs。（A）通过流式细胞仪测定起始和一轮流式分选后未预富集样本中ILCs的纯度。（B）对EasySep™预富集的样本，在预富集之后立即检测ILCs纯度，并且进行一轮流式分选之后再次检测ILCs纯度。（C）以上相应步骤中细胞的纯度和流式分选的时间。
起始细胞总数为7.5x 107个细胞，流式分选前ILCs纯度为0.1%，仅用流式分选，最终ILCs纯度为74%，分选时间大约需要120分钟。为了获得97%的最终纯度（数据未显示），需要进行第二轮分选。从这些结果推断，处理2 x 109个细胞大约需要3200分钟的分选时间。相反，起始细胞为来源于同一供体的2 x 109个细胞，用EasySep™进行预富集将流式分选前的ILCs纯度从0.1%提高到27%，后续流式分选的时间缩短至12分钟，最终的Lin-CD127+细胞纯度为99%。如图3所示，EasySep™预富集的样本中的ILC1、ILC2和ILC3亚群仍有细胞因子分泌功能。
图3. 通过EasySep™预富集的ILCs仍具有功能性
从EasySep™预富集的样本中分离的ILC1、ILC2和ILC3s在无血清扩增培养基中单独培养，一组细胞给与刺激，对照组细胞不给予刺激。6天后，收集ILC1（IL-12和IL-15）、ILC2（IL-2和IL-33）和ILC3（IL-2、IL-1β和IL-23）培养物的上清液，用ELISA法分别检测IFNγ、IL-13和IL-17A的分泌。
总结
通过EasySep™对ILCs进行预富集，可以处理大体积的样本以分离不同的ILC亚群。EasySep™试剂盒提供了一种优化的细胞分选方法，能够在很短的时间内获得目的细胞。本技术公告中，我们展示了负选的实验流程如何快速的去除非目的细胞，以富集未经标记的稀有的ILCs，得到的细胞可立即进行下游的分析和分选。通过将流式分选与EasySep™相结合，大大减少了细胞分选的时间并获得了更高的细胞纯度。
参考文献
- Mjösberg JM et al. (2011) Human IL-25- and IL-33-responsive type 2 innate lymphoid cells are defined by expression of CRTH2 and CD161. Nat Immunol 12(11): 1055-62.
- Halim TYF & Takei F. (2014) Isolation and characterization of mouse innate lymphoid cells. Curr Protoc Immunol 106(5): 3.25.1-13.
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