实验步骤

小窍门：确保血样、密度梯度离心液（例如Ficoll™, Lymphoprep™）和缓冲液（例如含2% FBS, 且无钙、镁离子的PBS）均放置于室温。

1. 将血袋中的脐带血样本转移至无菌离心管或无菌瓶中。
2. 用移液枪去除比较明显的团块，如果团块过多，可使用70 µm细胞滤网过滤样本。
3. 在室温下用等体积的缓冲液稀释脐带血并轻轻混匀。
4. 在一个新的无菌离心管中加入密度梯度离心液。推荐的密度梯度离心液体积和试管规格可参见表1。



表1. 推荐的密度梯度离心液体积和试管规格

血样（mL）	缓冲液（mL）	密度梯度离心液（mL）	试管规格（mL）
1	1	1.5	5
2	2	3	14
3	3	3	14
4	4	4	14
5	5	15	50
10	10	15	50
15	15	15	50

5. 将稀释过的脐带血小心地加于密度梯度离心液之上。加样时将离心管倾斜45度可帮助避免密度梯度离心液与稀释过的血样混在一起。
6. 室温离心400 X g，30分钟，关闭刹车。
7. 弃掉含有血浆和大部分血小板的上清，在血浆和密度梯度离心液之间的界面收集单个核细胞，并将细胞转移至一个新的50 mL离心管。
   
   小窍门：有时很难在界面处看到细胞。为了保证最大的细胞回收率，可将一部分密度梯度离心液和细胞一并收集起来。使用新的移液管来收集单个核细胞层，以避免过多的血小板残留。
8. 在收集到的单个核细胞中加入3倍体积的缓冲液，或者直接加缓冲液至50 mL。室温离心300 X g，10分钟，关闭刹车。
9. 使用移液枪小心弃去上清。
   
   注意：细胞沉淀中因为有红细胞，所以会显得非常红。健康新生儿的脐带血中含未成熟有核红细胞，其浓度范围为0.03 – 4.8 x 10⁶细胞/mL。与更成熟的红细胞不同，这些未成熟有核红细胞可能会留在血浆和密度梯度离心液之间的界面²。
10. 重复洗涤步骤以减少血小板污染。将细胞重悬于缓冲液中，室温离心120 X g，10分钟，关闭刹车。用移液枪小心吸出并弃去上清液。将细胞重悬于所需的缓冲液或培养基中。
11. 通过细胞计数来确定细胞密度。

Ficoll是GE Healthcare Ltd.的商标，Lymphoprep是Alere Technologies的商标。

我们也提供SepMate™离心管, 可更快捷地通过密度梯度离心将全血和脐带血中的单个核细胞或特定细胞类型分离。

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