EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
从细胞中提取总RNA的操作流程
从细胞中提取总RNA的操作流程
- Document # 27175
- Version 1.0.0
- 12/3/19
实验介绍
以下从细胞中提取总RNA的操作流程使用总RNA纯化试剂盒（Total RNA Purification Kit，产品号 #79040）。需要了解更详细的信息，请参考技术手册（文件 #10000005434）。
实验流程
- 裂解贴壁细胞或悬浮细胞，流程如下所示。
贴壁细胞
- a) 吸除细胞培养基，取适量冰冷的无菌D-PBS清洗细胞（体积如表1所示）。吸除D-PBS。
- b) 加入适量RNA裂解缓冲液（RNA Lysis Buffer）+TG（体积如表1所示）。轻轻晃动培养板或者锥形管，直至液面完全覆盖细胞。用枪吹打7-10下，使裂解液和细胞充分接触。
- c) 收集裂解物，转移至微量离心管。
- d) 加入适量100%异丙醇（Isopropanol）（体积如表1所示），剧烈震荡5秒。
- e) 至步骤2进行RNA分离。
表1. 使用不同培养器皿情况下，D-PBS，RNA裂解缓冲液+TG，100%异丙醇的推荐体积
悬浮细胞
- a) 转移细胞悬液至离心管，300 x g，离心5分钟，吸除上清液。
- b) 加入适量冰冷的无菌D-PBS清洗细胞。300 x g，离心5分钟，尽可能地完全吸除上清液。
- c) 加入适量RNA裂解缓冲液+TG（体积如表2所示）。用枪吹打 7-10下，或剧烈震荡，使裂解液和细胞充分接触。如果细胞数量 >2 x 106，用装有20号针头的注射器反复抽吸4-5次。
- d) 加入适量100%异丙醇（体积如表2所示），剧烈震荡5秒。
- e) 至步骤2进行RNA分离。
表2. 不同细胞数量情况下，RNA裂解缓冲液+TG，异丙醇的推荐体积
- 将迷你柱（minicolumn）置于收集管（Collection Tube）中。
- 将步骤1中的裂解混合液转移至迷你柱中。
- 12,000 - 14,000 x g，离心30秒。取出小量制备管，移除收集管中的 液体，再把迷你柱插回收集管。
- 在迷你柱中加入500 µL RNA洗涤液（RNA wash buffer），12,000 - 14,000 x g，离心30秒。取出迷你柱，移除收集管中的液体，再把迷你 柱插回收集管。
- 按照表3所示顺序添加试剂，制备DNase I孵育混合液（DNase I Incubation Mix）。表3所示试剂体积为单次分离RNA所需的量。
- 混合各组分，轻轻用枪吹打混匀，不要剧烈震荡.，配制完毕后存放在 提取总RNA的操作流程 冰盒内或冰浴上。
- 将30 µL DNase I孵育混合液（步骤6制备）加到迷你柱的膜上。室温 （15-25℃）孵育15分钟。
- 加入200 µL（含乙醇）柱清洗液（Column Wash Buffer，with ethanol added）至迷你柱中。12,000 - 14,000 x g，离心15秒。
- 加入500 µL（含乙醇）RNA洗涤液至迷你柱中。12,000 - 14,000 x g， 离心30秒。将迷你柱转移至新的收集管中。
- 加入300 µL RNA洗涤液至迷你柱中。高速离心2分钟。
- 将迷你柱转移至洗脱管（Elution Tube）中，在膜上加入适量（体积如 表4所示）无核酸酶的水（nuclease-free water）。室温中孵育1-2分 钟。12,000 - 14,000 x g，离心1分钟。
- 移除迷你柱，将纯化的RNA保存在-80℃。
表3. 制备DNase I孵育混合液
表4. 不同细胞数量情况，无核酸酶的水的推荐体积
提取总RNA的操作流程
沪公网安备31010102008431号