嵌合分析中纯度检测的重要性

EFI和ASHI已官方认证纯度检测是谱系特异性嵌合分析中重要的步骤，然而很多嵌合实验室仍然不熟悉此程序。本篇技术公告回顾了谱系特异性嵌合分析的重要性，解释了纯度检测的必要性并提供了使用流式细胞分析进行纯度检测的指南。

分离细胞亚群可提高嵌合分析的灵敏度和实用性

谱系特异性嵌合分析是监测同种异体造血细胞移植（allo-HCT）结果的重要工具。基于移植的成功，宿主可以实现完全的供体嵌合，也可以达到混合嵌合状态，在这种状态下，宿主造血与供体造血在受体中共存¹。移植受体的嵌合状态可以提示疾病复发、移植物抗宿主病（GVHD）、移植物抗肿瘤效应（GVT）和其他结果的潜在动态^2-9。

研究特定细胞亚群的嵌合现象是一种越来越普遍的做法，与分析整个白细胞群相比，尤其是在非清髓同种异体造血细胞移植的接受者中，它具有更多优势^10,11。其中一个优势是增加了检测的灵敏度。若患者仅在一个或几个细胞谱系中有混合嵌合，那么宿主细胞可能由于总体比例过低而无法通过全血分析被检测到¹。此外，混合嵌合的重要性在不同的细胞亚群中也有区别。例如，最近的一项研究发现，根据T细胞和NK细胞（而非骨髓细胞）内的混合嵌合程度可将患者分为不同的移植排斥反应风险组¹²。在另一项研究中，完整的供体T细胞嵌合始终先于GVT效应¹³。最近的文献表明这种类型的谱系特异性分析对于嵌合实验室非常有用^14-18。

纯度检测可确保谱系特异性分析的可靠性

进行谱系特异性嵌合分析可以提高检测的灵敏度并提供必要的信息。但它们都取决于分离的细胞亚群的纯度，因为非目的细胞的污染会降低谱系特异性分析的可靠性。这些问题在病理样本中尤为常见，因为其中白细胞的数量和比例可能产生变化¹⁹。因此检测分离的细胞群的纯度是一个重要的质控步骤。截至2011年，EFI和ASHI的官方指南规定，在分析结果时，必须记录并考虑分离的细胞群的纯度。

流式细胞分析是最常用且准确的检测纯度的方法之一。以下内容描述了通过流式细胞分析进行纯度检测的详细步骤。

如何检测纯度

纯度检测在嵌合分析中至关重要，它可以确保细胞亚群没有被非目的细胞污染。最常用的检测纯度的方法是流式细胞术，即通过流式细胞仪分析被荧光标记的目的细胞，从而计算样本中每种细胞类型的比例。

选择合适的抗体进行染色

在制备用于纯度检测的样本时，需要根据细胞类型和分选方法（正选或负选）选择合适的染色抗体。表1展示了特定细胞类型的推荐染色试剂。

正选中使用的一些抗体可能完全或部分阻断细胞表面主要标记物。在这种情况下，有三种不同的染色方法来检测纯度：

1. 使用针对目的细胞群上其它细胞表面标记物的抗体。
2. 同时添加靶向细胞表面主要标记物的荧光染料偶联抗体（例如PE标记）以作为分选抗体混合物。
3. 使用荧光标记的二级抗体，比如FITC标记的山羊抗小鼠IgG。这些抗体将与用于正选的抗体结合。

负选分离未被标记的细胞。可以使用针对细胞表面主要标记物的抗体（例如T细胞的CD3和B细胞的CD19）对通过负选分离的样本进行染色。

所有EasySep™和RoboSep™分选试剂盒（文末可查看产品列表）的产品说明书（PIS）上都有用于检测纯度的染色步骤。请选择合适的PIS查看详细说明。

详细操作步骤：通过流式细胞术检测纯度

对细胞进行染色以进行流式细胞术

1. 细胞分选后，将100µL富集的细胞分到两个5 mL流式管中（将细胞浓度范围调整为1 x 10⁶ - 1 x 10⁷ cells/mL）
2. 根据抗体厂商的说明，在第一个流式管中加入适当荧光偶联单克隆抗体或抗体（请参见表1）。每个测试中抗体体积通常为5-20 µL。
3. 在第二个流式管中，加入适当的荧光偶联同型对照抗体（例如FITC小鼠IgG1）。
4. 若条件允许，向每个样本中加入活性染料，如propidium iodide（PI）或7AAD，以便在流式细胞分析中对死细胞进行圈门以获得更准确的结果。
5. 避光，在2-8℃或冰上孵育30分钟。
6. 使用1 mL PBS洗细胞。弃去上清液，然后将沉淀重悬于100 - 500 µL PBS或FACS鞘液中。若不能立即分析样本，可用1％多聚甲醛固定后避光在2 – 8℃下保存最多两周。

对样本进行圈门

为了准确地检测纯度，分析样品时将细胞碎片和死细胞圈在门外非常重要。嵌合分析中纯度检测的目的在于确保富集的细胞未被其它有核细胞污染。由于RBC和细胞碎片没有细胞核且不会影响下游DNA检测，因此应将它们从流式细胞分析中排除。

对目的细胞进行圈门：

1. 创建一个展示前向散射（FSC）VS. 侧向散射（SSC）数据的点图，对所有白细胞圈定一个门。在图的左下角可见RBC和细胞碎片，且被排除在门外（图1，左侧）。
2. 创建一个展示FSC vs细胞活性染色数据的点图。死细胞对细胞活性标记呈阳性且应被排除在门外。图1（右侧）展示了使用常见的细胞活性染料propidium iodide (PI)将死细胞圈出门外的例子。

检测样本纯度

每个样本收集10,000-50,000个细胞数。 样本纯度是圈门中相关染色抗体呈阳性的细胞的百分比（图2）。 纯度检测的过程将取决于所用的流式软件。

根据EFI和ASHI指南，需在报告中清楚记录纯度检测的结果。

欲了解更多详情，请通过info.cn@stemcell.com与我们联系。所有EasySep™和RoboSep™试剂盒的产品说明书（PIS）都提供纯度检测操作说明。

用于在嵌合分析中分离细胞的EasySep™试剂盒以及检测纯度的推荐抗体