EasySep™小鼠TIL（CD45）正选试剂盒
基于免疫密度直接从全血中高通量分离免疫细胞亚群
基于免疫密度直接从全血中高通量分离免疫细胞亚群
- Document # 28726
- Version 2.1.0
- 12/31/24
案例分析：使用RosetteSep™和SepMate™系统高通量分离自然杀伤细胞以评估体外细胞毒性
为简化直接从全血样本中分离免疫细胞的工作流程且实现高通量样本处理，马里兰大学医学院的Ajay Jain博士实验室采用了一种快速有效的自然杀伤细胞分离方法——RosetteSep™和SepMate™系统。该技术公告讨论了这种依赖免疫密度的快速细胞分离系统如何在不影响细胞功能或下游实验性能的情况下，将450mL血液中获得细胞的时间从四个小时减少到一个小时。
背景介绍
高通量细胞分离的需求
免疫细胞分离在药物研发、疫苗研究及转化免疫学等领域中发挥着重要作用。例如，通常需要分离免疫细胞来评估免疫刺激化合物的功效，评估候选疫苗的免疫原性或研究免疫系统与传染源之间的相互作用。1-4。
基于人原代细胞更具有生理相关性的测定方法的发展，需要一种快速有效的方法来从大量全血样本中分离免疫细胞2,4。为了实现这种高通量的细胞处理，STEMCELL Technologies开发了RosetteSep™和SepMate™系统，可在短短25分钟内迅速从全血中直接分离细胞。
RosetteSep™和SepMate™系统将独特的免疫密度细胞分离试剂（RosetteSep™）与专用细胞处理管（SepMate™）相结合，以减少细胞分离所需的步骤。这样可以节省时间，最大程度地减少用户之间的操作差异，并且可以进行高效且高通量的样本处理。使用这种细胞分离系统可产生未经标记的高纯度的细胞，而无需分离柱或免疫磁珠。获得的细胞可立即用于各种下游实验，例如细胞毒性测试、化合物筛选以及其它需要以最少的操作获得高活性和功能性细胞的应用。
RosetteSep™和SepMate™系统的评估
从血液中分离淋巴细胞的传统方法费力且费时，并且需要专业的技术操作。这些方法包括先通过密度梯度离心（DGC）分离外周血单个核细胞（PBMCs），再使用免疫磁珠有柱系统富集特定的细胞亚群。在马里兰大学医学院，Ajay Jain博士及其同事需要经常从大量人样本中分离出自然杀伤（NK）细胞。通过DGC后进行免疫磁珠有柱分选的方法从450 ml全血中分离NK细胞，需要花费4小时。此外，采用这种方法很难快速高效地处理多个样本5。为了找到可以简化工作流程并且实现更高通量样本处理的解决方案，Jain的实验室评估了RosetteSep™和SepMate™系统，以及该系统对NK细胞标志物表达和细胞毒性的影响。
实验方法
Jain博士的小组使用两种不同的方法评估比较了从450 ml全血中分离出的NK细胞的体外细胞毒性：DGC后进行免疫磁珠有柱法分离或使用RosetteSep™人NK细胞富集试剂盒与SepMate™结合的细胞分选系统（产品号 #15065和#85450）5。通过铬释放试验评估NK细胞对HT29结肠癌细胞和K562白血病细胞的细胞毒性。使用流式细胞术评估NK细胞激活标志物的表达。
实验结果
Jain博士的研究小组发现，使用RosetteSep™和SepMate™系统可以更快地分离NK细胞：450 ml的血液可以分为多个样本，并在一小时内处理完成。相比而言，通过DGC在进行免疫磁珠有柱法分离NK细胞的过程（DGC /免疫磁柱）则需要4个小时5。
通过RosetteSep™和SepMate™分离的NK细胞纯度高（通过流式细胞术评估为86.7%）且具有完整的细胞杀伤功能。为了量化效应细胞的细胞杀伤活性，Jain博士的小组通过体外测定方法来评估NK细胞杀死目标HT29结肠癌细胞（图1）和K562白血病细胞（数据未展示）的能力。HT29细胞表达高水平的表皮生长因子受体（EGFR），并且在抗EGFR抗体西妥昔单抗存在的情况下易受NK介导的抗体依赖细胞毒性的影响6。结果表明，用RosetteSep™和SepMate™系统分离的NK细胞保留了通过抗体依赖细胞毒性（图1）杀死HT29结肠癌细胞的能力，以及通过直接细胞介导的杀伤（此处未显示）杀死K562白血病细胞的能力5。通过流式细胞术评估NK细胞激活标志物的表达，结果表明，使用RosetteSep™和SepMate™分离的NK细胞与使用DGC/免疫磁珠分离的细胞具有相似的表达谱（图2）5。
图2. RosetteSep™和SepMate™分离的NK细胞显示出可比的激活标志物表达
分别使用DGC后再进行免疫磁珠（DGC/免疫磁珠分选），RosetteSep™人NK细胞富集抗体混合物（产品号#15065）和SepMate™（产品号#85450）系统，或RosetteSep™人NK细胞富集抗体混合物（产品号#15065）和SepMate™（产品号#85450）系统后再进行红细胞（RBC）裂解得到NK细胞。通过流式细胞术评估NK细胞表面和胞内激活标志物的表达。表达量用平均荧光强度（MFI）显示。除CD16外，通过DGC/免疫磁珠法分离的NK细胞与通过RosetteSep™和SepMate™系统分离且不进行RBC裂解的NK细胞在细胞表面和胞内激活标志物的表达上具有可比性。实验数据由Ajay Jain博士友情提供。
SepMate™管……在纯化的效应细胞和密度梯度离心液之间提供了机械屏障。目的细胞群被保留在屏障上方，无需专业操作即可从管中倾倒出。这种方法可以同时从多个供体中快速纯化NK细胞，CD8+和CD4+T细胞，使得下游应用能以高通量的方式进行（例如流式细胞术、ELISA、体外细胞毒性测试）。
引自EC等。（2013年）
结论
与密度梯度离心后再进行免疫磁珠分选的方法相比，RosetteSep™和SepMate™系统可在四分之一的时间内直接从全血中有效地对细胞亚群进行负选。RosetteSep™和SepMate™系统不需要非常专业的操作，即可同时从多个样本中快速分离细胞，并为高通量的下游检测提供功能性细胞。有关RosetteSep™和SepMate™系统及其原理的更多信息，请参阅第3页。
RosetteSep™和SepMate™系统的工作原理
RosetteSep™
RosetteSep™通过将不需要的细胞与红细胞交联形成玫瑰花环结构（图3），直接从血液中分离出高纯度的细胞。这些玫瑰花环结构在密度梯度离心过程中沉淀，使未经标记且高纯度的目的细胞留在血浆和密度梯度离心液之间的界面。
SepMate™的优势
结合SepMate™管使用可使RosetteSep™分离步骤更快且更简单。SepMate™插件可在样本和密度梯度离心液之间形成物理屏障，使样本可以快速移液或倒入试管中。离心时间减少到仅10分钟，纯化的目的细胞可以简单地倒入新试管中。SepMate™还可以单独使用，仅用15分钟轻松地从全血中分离PBMC。
为什么使用RosetteSep™和SepMate™系统？
- 在标准密度梯度离心步骤中，仅需25分钟即可从全血中分离未经标记的细胞亚群。
- 可从多种RosetteSep™试剂进行选择，以分离您感兴趣的细胞亚群。
- 获得高纯度、未经标记、具有高活力和功能性的细胞。
- 无需分离柱，磁极或其它仪器即可简单操作该系统。
- 将RosetteSep™与SepMate™结合使用可最大程度地减少分离之间的差异性，也可以单独使用RosetteSep™。
RosetteSep™和SepMate™操作流程
观看视频，了解如何结合使用SepMate™和RosetteSep™快速从全血中直接分离细胞亚群。
产品列表
用于细胞负选的RosetteSep™产品
用于细胞负去除的RosetteSep™产品
SepMate™产品
1. SepMate™（IVD）仅在加拿大、美国、欧洲和澳大利亚被注册为体外诊断（IVD）设备，以用 于通过密度梯度离心从人全血、脐带血和骨髓中分离出单个核细胞。该产品也在中国出售， 被中国食品药品监督管理局（CFDA）认定为非医疗器械，因此可被用于一般实验室设备。
2. SepMate™（RUO）在未被注册为IVD设备的区域仅供研究使用（RUO）。
密度梯度离心液
1. Lymphoprep™具有与Ficoll-Paque®相同的密度，可以代替Ficoll-Paque®，而无需更改现有现有操作流程。
参考文献
- World Health Organization. (2005) WHO Guidelines on Nonclinical Evaluation of Vaccines. Technical Report Series, No. 927. Clin Transplant 18(5): 558–563.
- Slater K. (2001) Cytotoxicity tests for high-throughput drug discover. Curr Opin Biotechnol 12(1): 70–4.
- McMillin DW et al. (2012) Compartment-Specific Bioluminescence Imaging platform for the High-throughput evaluation of antitumor immune function. Blood 119(15): e131–8.
- Sáez-Cirión A et al. (2010)Ex vivo T cell-based HIV suppression assay to evaluate HIV-specific CD8+ T-cell responses. Nat Protoc 5(6):1033–41.
- So EC et al. (2013) A high throughput method for enrichment of natural killer cells and lymphocytes and assessment of in vitro cytotoxicity. J Immunol Methods 394(1–2): 40–8.
- Schlaeth M et al. (2010) Fc-engineered EGF-R antibodies mediate improved antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) against KRAS-mutated tumor cells. Cancer Sci 101(5): 1080–8.
沪公网安备31010102008431号