以下操作流程适用于使用TeSR™-E7™（产品号 #05914）或ReproTeSR™（产品号 #05926）培养基以及游离性载体（Episomal Vector System），将尿液衍生细胞（UDCs）重编程为诱导多能干细胞（iPS）。

设备需求

Neon® Transfection System（Life Technologies 产品号 #MPK5000）

注意：此处描述的方法使用Neon® Transfection System和游离性载体 （episomal vectors，含有重编程因子）对体细胞进行转染。也可以使用 其他载体系统或电穿孔装置（如Lonza Nucleofector™或BioRad Gene Pulser Xcell™），但是操作流程将需要根据转染效率和活性进行优化。

所需材料和试剂

转染

• Neon® Transfection System 100 μL Kit (Life Technologies 产品号 #MPK10025)

重编程培养基

准备TeSR™-E7™培养基（产品号 #05914）或ReproTeSR™培养基（产品号 #05926）进行重编程。有关转染完整流程以及细胞的存储和稳定性，请参 阅对应产品的完整信息表（PIS——TeSR™-E7™：文件#DX22190, ReproTeSR™：文件#DX22191）

尿液衍生细胞的分离和扩增培养基

1. 将表1中所示的成分添加到含15 mM HEPES（产品号 #36254）的 DMEM / F-12中，准备尿液衍生细胞分离（UDCI）培养基和尿液衍生 细胞扩增（UDCE）培养基。按比例调整基础培养基和添加物。
2. 混合均匀。
   
   注意：如果不立即使用，UDCI或UDCE培养基可在2-8℃存储长达2周。

用于表达重编程因子的载体

以下游离性载体可从Addgene上获取：

• pCE-hOCT3/4 (Plasmid #41813)
• pCE-hSK (Plasmid #41814)
• pCE-hUL (Plasmid #41855)
• pCE-mp53DD (Plasmid #41856)
• pCXB-EBNA1 (Plasmid #41857)
或
• Epi5™ Episomal iPSC Reprogramming Kit（Thermo Fisher产品 号 #A15960）

用法说明：

请在无菌条件下准备试剂和进行以下操作。以下教程描述了如何从尿 液中分离和扩增用于重编程的细胞。细胞的起始数量以及生长速度会 由供体的不同而产生区别（年龄、性别、健康状态等）。一般来说，100 mL尿液样本中含有足够的细胞进行重编程。建立样本的成功率随着 尿液样本量的增加而提高。初始培养样品（尤其是女性样品）可能包 含非粘附细胞，但这些细胞会在更换培养基时去除。以下实验流程各 参数按照12孔培养板优化。

I. 尿液衍生细胞的分离和培养

A. 分离尿液衍生细胞

请在尿液样本收集后的4小时内处理样本，如果未能及时处理，实验 的成功率将随着样品处理的延迟而逐步降低。

1. 准备足够的UDCI培养基，分装，并加热至室温（15-25℃）。加入 Y-27632至终浓度为10 μM。
2. 制备明胶包被的12孔板，在每孔中添加0.5 mL 0.1％明胶水溶液 并在室温下孵育至少10分钟。
3. 将尿液转移到50 mL无菌离心管中，300 x g，离心5分钟。
   
   注意：如果样本不能立即使用，请按照Section C中的说明冷冻保 存细胞。
4. 小心吸出上清液，仅在试管中保留少量（~1 mL）残留。轻柔地混 匀细胞，合并所有样本至50 mL离心管。
   
   注意：用D-PBS清洗离心管，合并样品至同一离心管中，提高细胞 得率。
5. 向合并的样品中加入10 mL D-PBS，300 x g，离心5分钟。
6. 除去上清液，并将细胞重悬于1 mL含10 μM Y-27632的UDCI培 养基中（步骤1制备）。
7. 吸出培养板（步骤2制备）中的明胶水溶液。加入细胞悬液，37℃ 培养24小时。
8. 吸出培养基，并加入2 mL 37℃的UDCI培养基。
9. 每2-3天完全更换一次UDCI培养基。正常情况下，细胞集落将 在第10天左右出现。有关建立UDC培养物的示例图，请参见图 1A-B。
10. 当第0代UDC培养物饱和度足够时（即UDC集落直径至少达到1000µm或培养物的满板成度达到>30％饱和；请参见图1A-B），就可以准备对细胞进行传代。参考B部分的步骤1-8，使用UDCE培养基，按照1：1的比例对初始体系进行传代。

B. 尿液衍生细胞的传代

当第1代的UDCs达到80-90％饱和时（如图1C-D所示，请按如下操作 流程进行传代）。

1. 准备足够的UDCE培养基，并预热到室温（15-25℃）。
2. 准备12孔培养板，在12孔培养板的每一个孔中加入0.5 mL 0.1％ 明胶水溶液，并在室温下静置至少10分钟。
3. 吸出培养基，并使用D-PBS洗涤。吸出D-PBS。
4. 每孔加入500 μL Trypsin-EDTA（0.25％）。室温下孵育3-8分钟， 或观察到细胞从底部脱离。
5. 每孔加入1 mL UDCE培养基。使用细胞刮刀（Cell Scraper）刮起 细胞，并将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
6. 300 x g，离心5分钟。
7. 除去上清液，添加UDCE培养基。使用台盼蓝和血细胞计数器进 行活细胞计数，也可以采用其他类似的计数方法。
8. 以10,000-15,000个细胞/ cm²的密度接种细胞并在37℃下孵 育。
9. 每两天完全更换一次UDCE培养基，直到获得足够多的细胞数量 进行重编程。
   
   注意：持续监测培养物，如果未检测到污染，则不需要再加入抗 菌剂。
10. 至第II节进行重编程。
    
    注意：UDCs的重编程效率会随着每一次传代而降低；建议采用4 代之前的UDCs进行重编程。

C. 尿液衍生细胞的冷冻保存

当UDC培养物达到80-90％饱和时（如图1C-D所示），可以按需对细 胞进行冷冻保存。

1. 吸出培养基，并用D-PBS洗涤细胞。移除D-PBS。
2. 每孔加入500 μL Trypsin-EDTA，在室温下孵育3-8分钟，或观察 到细胞从底部脱离。
3. 每孔加入1 mL UDCE培养基。使用细胞刮刀收集细胞，并将细胞 悬液转移至15 mL离心管中。
4. 300 x g，离心5分钟。
5. 吸出上清液，加入2-8℃的CryoStor® CS10，混合均匀，然后将细 胞悬液转移至细胞冻存管中。有关完整的处理说明，请参阅PIS（文件#29941）。
6. 使用标准的慢速控制冷却操作流程（约-1℃ /分钟）或异丙醇冷 冻容器冷冻细胞，并在液氮温度（-135℃）下储存。
   
   注意：不建议在-80℃下长期保存。

II. 重编程尿液衍生细胞

以下方案（图2）针对6孔板进行了优化。如果使用其他培养器皿，请相应调整参数。

A. 包被培养板

使用TeSR™-E7™或ReproTeSR™对UDC进行重编程，需要使用Corning® Matrigel® hESC-Qualified Matrix包被培养板。有关包被培养器皿的完整说明，请参阅mTeSR™1技术手册（文件 #28315）或TeSR™-E8™技术手册（文件 #DX20809）。

B. 准备与转染尿液衍生细胞（第0天）

1. 按照2 mL每孔的剂量准备足够的UDCE培养基，添加 Y-27632， 使其终浓度为10 μM并额外准备10 mL。以1 mL /孔添加到 Matrigel®包被的6孔板中。
2. 分装10 mL添加了10 μM Y-27632的UDCE培养基，与培养板一 起孵育在37℃。
3. 准备UDCs的电穿孔，吸出培养基，并用D-PBS洗涤细胞两次。移 除D-PBS。
4. 每孔加入1 mL Trypsin-EDTA（0.25％）。室温下孵育3-8分钟，或 观察到细胞从底部脱离。
5. 当细胞完全飘起之后，加入1.5 mL UDCE培养基混合。将细胞悬 液转移至15 mL离心管中。
6. 300 x g，离心5分钟。除去上清液并将细胞重悬于5 mL D-PBS 中。
7. 使用台盼蓝和血细胞计数板进行活细胞计数。
8. 将适当体积的细胞悬液分装至离心管中，以获得足够的细胞进行 电穿孔。我们建议的细胞数量至少应为每个反应所需细胞数量 的1.25倍（在使用100 μL Neon®移液器枪头进行1个反应的条件 下，需要6.875 x 105个细胞）。300 x g，离心5分钟。
9. 吸出上清液并将细胞重悬于电穿孔悬浮液中，使其终浓度达到 5.5 x 106细胞/ mL。
   
   注：如果使用Neon®transfection系统，则将6.875 x 10⁵个细胞 重悬于125 μL重悬液R中。建议多准备25％额外体积的细胞悬 液，以避免将空气吸Neon®移液器枪头中。
10. 将细胞悬液转移至微量离心管中。每有1百万个细胞则向细胞悬 液中加入4 μg所需每种游离性载体，混合均匀。例如，如果溶液 具有6.875 x 10⁵个细胞，则每种载体添加2.75 μg。
11. 根据产品手册说明，对细胞进行电穿孔。
    
    注意：如果使用Neon® Transfection系统，我们建议在 Neon® 100 μL移液器枪头中使用1200 V，30 ms脉冲宽度和1个 脉冲。
12. 将转染的细胞转移到装有10 mL 37℃ UDCE培养基（在步骤2中 制备）的15 mL离心管中。
13. 将细胞以25,000-50,000个细胞/孔的密度接种到步骤2中制备的 6孔板中。
    
    注意：根据重编程细胞的生长动力学，可能需要优化接种的细胞 密度。
14. 添加UDCE培养基（在步骤2中制备）至每孔最终体积为2 mL。

C. 在TeSR™-E7™或ReproTeSR™中进行重编程诱导

1. 第1天：吸出原培养基，加入2 mL 37℃ UDCE培养基。37℃下孵 育2天。
2. 第3天：吸出培养基，并加入2 mL重编程培养基（TeSR™-E7™或 ReproTeSR™）和UDCE培养基的1：1混合物。
3. 第4-25天：从第4天起，每天或每两天完全更换一次重编程培养基 （2 mL）。当细胞密度较低时（图3A-B），可以每两天更换一次培 养基。当出现细胞集落，培养基开始变黄，就需要每天对培养基 进行更换（图3C-F）。
4. 至D部分评估重编程效率，并继续至E-F部分分离集落并在维持 培养基中培养。

D. 检测重编程效率

在第15-25天，大型的类胚胎干细胞集落将出现在重编程培养物中 （如图3E-F所示）；在此阶段，我们可以评估重编程的效率。使用转染 后孔中接种的iPS细胞集落总数和/或总面积比之接种的细胞总数，以 百分比计算重编程效率（B部分第13步）。

E. 分离iPS细胞集落并转移至TeSR™-E8™或mTeSR™1 中培养

在第15-25天，将出现细胞集落，形态上类似于人胚胎干细胞集落（图 3E-F）。一旦集落直径达到500-1000 μm，请将细胞刮下传代，并将其 培养于hPSC维持培养基（例如mTeSR™1或TeSR™-E8™）中。以下方案， 请使用实体显微镜（stereomicroscope），在无菌条件下进行。

1. 每孔加入2 mL mTeSR™1或TeSR™-E8™（6孔板使用Matrigel®或Vitronectin XF™ 产品号 #07180预包被）。
   
   注：为了提高亚集落片段（subcloned fragments）的存活率，第一 次传代时需要使用含有10 μM Y-27632的培养基。
2. 使用22号针头或极细头的玻璃移液管，刮掉那些未被重编程的 细胞（例如上皮细胞），重编程不完全的细胞，或者已经分化的 细胞，仅保留iPS细胞集落。
3. 使用针头或极细的玻璃移液管，将iPS细胞集落切成小碎块。
4. 使用200 μL有过滤器的枪头，用吸头刮起细胞集落碎片，吸到 枪头中。快速将集落碎片转移至步骤1中制备的6孔板中进行培养。

F. 建立新的iPS细胞系和细胞质量监测

对于前1到2代，我们建议对iPS细胞系进行手动传代，减少非重编 程或未分化细胞的存在，提高iPS细胞系的纯度。一旦建立了iPS细 胞系，请参照技术手册在mTeSR™1（文件#28315）或TeSR™-E8™ （#DX20809）中维持培养人多能干细胞中的方法对细胞进行酶传代。

为了确保iPS细胞系的高质量，我们建议持续监控细胞的形态（图 5A-B），未分化状态标志物的表达情况（图5C-D），以及细胞的多能性 （图6）。对于监测基因组完整性，我们建议使用hPSC基因检测试剂 盒通过Giemsa banding（G-banding；图5F）检测hPSC培养物中最常 见的核型异常（图5E）。此外，未分化的hPSC表达的一些标志物（如 OCT4和TRA-1-60；图5C-D）不能代表hPSC的多能性。hPSC多能性可 通过多种不同的测定方法进行评估，包括使用STEMdiff™三谱系分化。