使用SFEM II和UM729对CD34+细胞进行无血清扩增

我们之前已经讨论过用于扩增CD34⁺细胞的细胞因子添加物。本期向大家介绍如何使用StemSpan™ SFEM II培养基、StemSpan™ CD34+扩增添加物和小分子在无血清条件下生成大量CD34⁺细胞。这些培养条件可促进原始CD34⁺CD45RA^-CD90⁺祖细胞在培养7天后扩增超10倍。

所需的细胞/试剂/耗材：

*规格因实验需求而异，具体参考表1
**当终浓度为175 nm时，UM171也可获得相似结果

步骤一：获取CD34⁺细胞
CD34⁺细胞的来源包括从CB或骨髓（BM）中分离并冻存的市售产品人脐带血 CD34⁺细胞，或者使用无柱细胞分选系统从CB或新鲜BM中自行分离。

关于起始细胞来源您可能会关心以下问题：

使用新鲜还是冷冻的原代细胞？
一般来说，如果样本中造血祖细胞含量、质量以及活力良好，无论是新鲜或冻存的样本均可进行CD34⁺细胞的分选及扩增培养，就好比使用高质量的冻存脐带血进行分选，其效果要优于使用“质量差”的新鲜脐带血样本。
当样本是新鲜或冷冻的全血或骨髓，应该使用哪种EasySep™试剂盒？
有关如何根据细胞来源选择细分选产品的更多信息，请参阅我们的技术指南“分离造血祖细胞”。如果您要从新鲜CB中分离CD34⁺细胞，使用EasySep™人脐带血CD34正选试剂盒II是最佳选择之一。

步骤二：细胞培养板的选择和培养方案
StemSpan™ SFEM II培养基可在多种细胞培养板中扩增CD34⁺细胞。表1列出不同规格细胞培养板推荐铺板的细胞数量，具体的培养方案可根据实验目的和细胞质量进行优化。

表1 不同规格细胞培养板推荐铺板的细胞数量

培养板规格*	适用实验场景	每孔体积	每孔起始细胞数量	每瓶SFEM II培养基可接种的培养板数量**
培养板规格*	适用实验场景	每孔体积	每孔起始细胞数量	100 mL规格	500 mL规格
6孔板	获取足够量的CD34⁺细胞供下游实验研究	2 mL	2 x 10⁴	8	41
24孔版	获取足够量的CD34⁺细胞供下游实验研究，且适用于进行多条件筛选实验	1 mL	1 x 10⁴	4	20
96孔板	进行不同实验条件的通量研究	100 μL	1 x 10³	10	52

*经组织培养处理和未经组织培养处理的培养板均适用于CD34+细胞的培养
**StemSpan™ CD34+扩增添加物以10 mL 10X浓缩液形式提供。

推荐培养方案
第0天：在含有StemSpan™ CD34⁺扩增添加物的SFEM II培养基中培养目的细胞，推荐向培养基中添加UM729至终浓度为1 μM*，用于增强HSC的自我更新。细胞培养板及接种密度参考表1。

第7天：一般来说，在培养的第7天无论是细胞产量、CD34表达还是祖细胞功能都处于最佳状态，此时可收获细胞进行评估或下游应用。

注：如果只考虑CD34表达和祖细胞功能则可相应缩短培养时间，如果考虑需要得到更多的细胞则可延长培养时间，但CD34表达和祖细胞功能会随着培养时间的延长而降低。针对培养时长超过7天的方案，推荐在第4天补充新鲜培养基，在第7天进行换液或者重新铺板，以此维持细胞的活力。

*根据实验条件进行浓度优化。有关UM171和UM729数据比较的更多信息，请参阅 Fares 等人在2014年发表的刊物。

步骤三：下游应用的定量
培养结束后建议对总细胞数和活细胞数进行计数，例如使用台盼蓝和血细胞计数器，或使用自动细胞计数方法，并通过流式细胞分析CD34+表达。可选步骤包括通过免疫表型分析来鉴定培养物中产生的CD34⁺细胞亚群和/或分化的CD34⁺细胞。我们的最新挂图，主题有关用于免疫表型分析或荧光激活细胞分选 (FACS) 的人造血干/祖细胞 (HSPC) 细胞表面标志物的信息，您可以点击链接获取详情。

注：CD34⁺细胞上的抗原表达在培养过程中发生变化。

预期结果
S添加有CD34⁺扩增添加物的SFEM II培养基支持CD34⁺细胞的高效扩增。除CD34⁺CD45RA^-CD90⁺sup>细胞等更原始的亚群之外，添加UM729或UM171可进一步增强CD34⁺细胞的扩增（与不含这些小分子之一的培养物相比，第7天约为10倍）。

图1.在StemSpan™ SFEM II中培养的CD34⁺细胞

CD34⁺细胞在仅含有CD34⁺扩增添加物 (Exp) 或添加UM171（终浓度为 175 nM）的StemSpan™ SFEM II中培养。当使用终浓度为1 μM 的UM729时，会出现类似培养结果。图示培养7天后总有核细胞 (TNC)、CD34⁺、CD34⁺CD45RA^-和 CD34⁺CD45RA^-CD90⁺细胞亚群的平均扩增倍数。显示的数据为平均值±SEM (n=7)。P值使用双尾配对Student’s t-test计算（*P < 0.05；**P < 0.01）。

扩增的CD34+细胞适用于多种下游应用，例如集落形成单位 (CFU) 测定或重编程为诱导多能干细胞 (iPSC)。

如需本产品的进一步信息，请联系info.cn@stemcell.com。

此技术指南作为我们Hematopoiesis Hub研究的一部分，点击访问更多技术信息！

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