引言

以下是用IntestiCult™类器官生长培养基（人）（IntestiCult™ OGMH；产 品号 #06010）培养肠类器官的补充操作实验流程。本文档含有：分化肠 类器官，建立单层肠上皮培养体系，冻存和复苏肠类器官的实验流程。 如需完整的培养方法，请同时用本篇技术手册和产品说明书（文档号 DX21423）。产品说明书内包含所需实验材料，怎样从活检样本中分离人 结肠隐窝，从隐窝样本建立人类器官，还有怎样进行类器官的培养、扩增 和传代。

实验材料

分化肠类器官

IntestiCult™ OGMH被优化于人结肠和小肠上皮类器官的建立和高效扩增 培养。和普通成熟肠组织相比，可传代的这些肠上皮类器官中含有更多的 干细胞和祖细胞。本方案描述了通过建立类器官以获得高度分化细胞的 方法。分化后，这些单层细胞形态变厚且具有明显柱状结构，此为肠道终 末分化细胞具有的特征。请注意，按照该步骤得到的分化的类器官不含有 显著的成熟干细胞群，且不能进一步扩增或传代。

准备所需的培养基

下例为制备100 mL的肠类器官分化培养基（IntestiCult™ OGMH Component A + DMEM/F-12 with 15 mM HEPES）。如果制备其它体 积，请调整相应添加物的量。

1. 在室温（15 - 25℃）或在2 - 8℃过夜解冻IntestiCult™ OGMH Component A，混合均匀。解冻后须立即使用，或分装储存于-20℃ （最长储存3个月）。分装后的培养基在解冻后须立即使用，不可反 复冻融。
2. 向50 mL DMEM/F-12 with 15 mM HEPES中加入50 mL IntestiCult™ OGMH Component A，混合均匀。如不立即使用，可在 2 - 8℃储存最多1个星期。
3. 使用前加入抗生素（例如：50 μg/mL庆大霉素）。

肠类器官的分化

1. 根据产品说明书（文件号：DX21423）建立类器官3D培养体系。 分化前，类器官需最少经过一次传代。如果类器官是用其它培养 体系建立的，则需在IntestiCult™ OGMH中至少传代三次才可以 开始分化步骤。
2. 传代开始时（0天），根据标准操作步骤接种于IntestiCult™ OGMH（将Component A和Component B以1：1混合）。在37℃ 和5%的CO₂条件下培养。
3. 在第2天和第4天使用IntestiCult™ OGMH进行完全换液。
4. 在第5天，将培养基换成肠类器官分化培养基（Intestinal Organoid Differentiation Medium）以开始分化。在37℃和5% 的CO₂条件下进行培养。
   注意：根据类器官的生长尺寸和状态不同，可将分化前的维持培 养阶段延长到9天（图1）。如果类器官在培养9天后还没有达到 适合分化的状态，则每隔2天使用IntestiCult™ OGMH进行一次 完全换液。
5. 培养基更换为Intestinal Organoid Differentiation Medium后， 类器官可继续培养5天。通常在2到3天后就可看到分化的特征（ 图2），包括类器官单层上皮细胞变厚，因为细胞开始呈现柱状形 态、出现杯状细胞或其它终末分化类型的细胞、随时间推移出现 死细胞和凋亡细胞的聚集。

肠类器官的单层培养

肠类器官为研究人员提供了更具生理相关的细胞模型，并被广泛应 用于各个研究领域，以提高实验设计的灵活性和精确度。但是，肠类 器官的封闭腔室结构不适用于某些特定的实验研究，造成了它的局限 性。该操作步骤描述了如何使用建立好的稳定扩增的肠类器官建立单 层肠上皮培养体系的方法。单层肠上皮培养体系具有外露的单层上皮 的顶面，从而适合多种研究，比如，研究顶端细胞表面受体、与共生或 病原微生物的相互作用、模拟肠内容物中潜在的有益或有害物质的作 用。单层肠上皮培养体系可培养在玻璃盖玻片上以实现高质量图形成 像，也可以培养在Transwell®上以检测物质穿过上皮层的主动和被动 运输，和电荷屏障功能性检测。单层培养物可以通过不同培养器皿建 立，以灵活适应不同培养体系。

在下面操作步骤中，以类器官形态扩增得到的细胞被接种于被稀释的 培养基质上，形成均一融合的单层并且在7天内分化形成肠上皮。通过 定期换液，可将单层培养物维持培养最多3周。

培养皿的包被

单层肠上皮的培养首先要用稀释的Matrigel®溶液对培养皿进行包 被。以下步骤适用于使用Corning® Matrigel®进行包被。其它基质液 如Collagen I、Collagen IV、Vitronectin XF（产品号# 07180）也可以 用于包被（详细步骤请参考产品说明书）。

1. 将分装后的一份Corning® Matrigel®在冰上解冻。
2. 取适量冷的（2 - 8℃）D-PBS至锥形管中并放在冰上。推荐用量 请参照表1。
3. 将已解冻的Matrigel®加入到冷的D-PBS里，比例是1 μL的 Matrigel®加入49 μL D-PBS。混合均匀，置于冰上。
4. 立即用稀释的好的Matrigel®对组织培养处理的（tissue culture-treated）培养皿进行包被。包被液体积推荐用量请参考表1。
   注意：保证包被液均匀覆盖培养皿底部；包被液不足会导致细胞 无法贴壁。
5. 在使用前至少在37℃孵育1小时。避免使Matrigel®溶液挥发。
   注意：如果不立即用，用封口膜密封培养以防止Matrigel®溶液挥 发，可在2 - 8℃存放最多1周。继续下一步骤前应将之前储存的 Matrigel®溶液在室温复温30分钟。
6. 慢慢倾斜培养皿使多余的Matrigel®溶液聚集到边缘。吸取出多 余的Matrigel®溶液，注意不要刮到包被表面。

制备培养基

下例为制备100 mL的单层生长培养基（IntestiCult™ OGMH Component A + IntestiCult™ OGMH Component B + Y-27632）。如 需制备不同体积，可根据以上比例调整。

1. 在室温（15 - 25℃）或在2 - 8℃过夜解冻IntestiCult™ OGMH Component A和Component B。
   注意：解冻后立即使用，或分装储存在-20℃，最多可保存三个 月。分装的样本解冻后立即使用，不可反复冻融。
2. 将50 mL的Component B加入50 mL的Component A。混合均匀。
3. 加入10 μM的Y-27632。混合均匀。
   注意：如果不立即使用，可在2 - 8℃保存最多1周。
4. 使用前加入抗生素（如，50 μg/mL庆大霉素）。

将肠类器官接种为单层培养体系

1. 按照以下描述收集3 - 4个类器官的Matrigel® domes（约含100 - 150个类器官）。使用不同培养皿时建议收集的dome数量请参 考表2。
2. 向每个含有dome的孔中加入1 mL的温和细胞解离试剂（Gentle Cell Dissociation Reagent，GCDR）。
3. 室温（15 - 25℃）孵育1分钟。
4. 使用1000 μL的移液枪头，用力吹打以吹散Matrigel® dome结构 并重悬类器官。
5. 将悬液在室温孵育10分钟，同时轻柔的搅动或震荡。
6. 将几个孔的悬液混合。200 x g，2 - 8℃，离心5分钟
7. 弃去上清液。加入3 mL冷的DMEM/F-12。200 x g，2 - 8℃，离心5分钟。
8. 吸出尽量多的上清液，尽量不要打扰到底部沉淀。将类器官重悬 于1 mL预热的（37℃）Trypsin-EDTA（0.05%）中。
9. 用1000 μL的移液枪头将悬液吹打混匀。将类器官在37℃孵育5 - 10分钟。
10. 用力吹打或涡旋以尽量混匀并破坏类器官。将类器官放在显微 镜下观察以确认其结构被破坏。类器官应该被分散成单个细胞 或小的类器官片段（fragment）。如果有大量大的fragment或整 个类器官存在，应重复吹打或涡旋步骤以保证碎片被分散 （图3）。
    注意：以下的步骤需尽快完成，因为细胞容易发生聚集。
11. 加入1 mL DMEM/F-12后吹打混匀。将碎片以200 x g，2 - 8℃， 离心5分钟。
12. 弃去上清液并将类器官碎片重悬于Monolayer Growth Medium 中，详情参考表3。
13. 缓慢轻柔地将细胞悬液加入孔中。在37℃和5% CO₂培养。每天 观察成长情况。每隔2 - 3天进行培养基完全换液。
    注意：单层一般在2 - 3天达到100%汇合率（满板程度）；若贴壁 效果不好，则扩增速度会减缓。但给予足够的培养时间后，汇合率 仍然会达到100%。

培养开始后，如果保证按时换液，细胞活力和单层的汇合率可维持至 少3周。如果需要进行特定实验，可以用DMEM/F-12替换Monolayer Growth Medium。单层可在DMEM/F-12中维持细胞活力和完整性至 少24小时。单层可在Intestinal Organoid Differentiation Medium维 持至少1周以进行进一步分化。

肠类器官的冻存

本操作步骤适用于每冻存管中冻存200个类器官。在类器官成熟时（ 传代铺板后7 - 10天）进行冻存效果最佳。
注意：原代和冻存后培养的肠类器官应该在两次传代后再进行冻存。 囊泡状的或出芽的类器官与较小、深色或破碎的类器官相比，复苏后 的细胞活力会更高。

1. 把D-PBS（不含Ca++和Mg++）、含有15 mM HEPES的 DMEM/F-12和CryoStor® CS10放在冰上。
2. 计数每个孔里的成熟类器官的数量。由于我们推荐一个冻存管中 冻存200个类器官，可将几个培养孔中的类器官合并到一起。
3. 把培养基从每个孔里取出，加入1 mL的预冷的D-PBS。
4. 使用预冷、湿润的1000 μL枪头上下吹打Matrigel® dome 10 - 20次，将其打碎。将含有200个类器官的悬液放入15 mL的 尖底离心管中。可以合并多孔中的类器官至200个进行冻存。
5. 使用1 mL预冷的D-PBS清洗每个孔，然后将清洗液转移至15 mL的尖底离心管中。
6. 将类器官在2 - 8℃、290 x g离心5分钟。小心移除上清液，不要 触碰类器官团块。
7. 加入7 - 10 mL的预冷的含有15 mM HEPES的DMEM/F-12。轻 弹管子、或者使用枪头轻轻上下吹打，以重悬类器官。在2 - 8℃ 、290 x g再次离心5分钟。小心移除上清液，不要触碰类器官团 块。
8. 在冻存管中使用1 mL预冷的CryoStor® CS10重悬类器官团块。
   注意：这步要尽快完成，以防还未上冻的类器官过长的暴露在 CryoStor® CS10中。
9. 使用同样的枪头，将重悬后的类器官转移到标注好的冻存管中。 将冻存管放入冻存盒中。
10. 将冻存盒放入-80℃冰箱24小时，之后将冻存管转移到液氮中进 行长期保存。不推荐在-80℃进行长期保存。

复苏冻存的肠类器官

1. 冰上解冻120 μL Matrigel®。并将IntestiCult™ OGMH培养基恢 复到室温。24孔板的4个培养孔约需要3.1 mL培养基。将24孔培 养板（组织处理过，产品号 #38017）放入37℃孵箱中预热至少 30分钟。
2. 准备Wash Solution：在50 mL离心管中加入2 mL的25%牛血清 白蛋白（BSA）母液和48 mL含有15 mM HEPES的DMEM/F-12。 实验中放于室温，可在2 - 8℃保存最多6个月。
3. 将室温放置的2 mL Wash Solution（第2步中制备）加入15 mL的 尖底离心管。
4. 在37℃的水浴锅中解冻类器官。当冻存培养基变为液体时解冻 完成，此时可肉眼可见观察到类器官沉降于冻存管底部。37℃的 解冻过程大概需要2 - 2.5分钟，培养基过热会影响解冻后类器 官的生长。
   注意: 类器官解冻完成应立即开始下一步，以免影响细胞活力。 不建议将类器官暴露于反复的冷冻-解冻循环中。
5. 使用一个1000 μL的枪头，将解冻后的类器官悬液中加入1 mL Wash Solution。使用预先湿润的枪头，上下吹打4次，混合均匀。 马上将冻存管中的液体转移入预先加入2 mL Wash Solution的 15 mL尖底离心管（第3步中制备）中。
6. 使用1 mL Wash Solution冲洗冻存管2次，转移入离心管中。确 保冻存管内部被清洗完全，包括冻存管盖子的内部。
7. 类器官悬液在2 - 8℃，200 x g离心5分钟。小心的移除上清。避 免引入气泡，如果存在气泡，建议在吸除上清前先将气泡吸除。
8. 使用一个200 μL的枪头，加入100 μL IntestiCult™ OGMH重悬 类器官。
9. 使用一个200 μL的枪头，加入100 μL Matrigel®。上下吹打5 - 10 次混合均匀，保证样本中类器官的均匀分布。移液枪使用第一 档，避免引入气泡。
10. 使用预先湿润的200 μL枪头，加入50 μL的类器官悬液至预热的 24孔板（第一步中准备的）中，在每孔中心形成一个圆顶状的液 滴（dome）。接种时，移液枪依旧使用第一档，避免引入气泡。在 37℃，5% CO₂中孵育10分钟，使Matrigel®固化。
11. 向接种有Matrigel® dome的培养孔沿孔壁加入750 μL IntestiCult™ OGMH。不要直接将培养基加入到固化好的 dome上。
12. 没有使用的培养孔需要加入无菌的D-PBS。盖好盖子，于37℃， 5% CO₂中培养。每周进行3次完全培养基换液。
13. 为了最佳效果，在进行实验前，解冻后的类器官先进性2次传代。 解冻后第一代类器官的生长可能会比较慢。解冻后，类器官通常 在7 - 14天后可以进行传代，初次传代后应在7 - 10天后可进行 传代。

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