为评估细胞在使用STEMdiff™三胚层分化试剂盒后向三谱系分化的结果，细胞需要被收集并/或固定进行谱系标记物的鉴定。中胚层和内胚层分化需在第五天收集细胞，外胚层分化在第七天收集细胞。鉴定方法可以选择流式、免疫化学、或转录组分析。如果要通过流式或免疫细胞化学鉴定分化，需使用每个胚层的特异性的荧光偶联抗体进行细胞标记，例如：

• 外胚层: PAX6结合Nestin (例如Anti-Human Nestin Antibody, Clone 10C2, )
• 中胚层: Brachyury (T)结合NCAM或者CXCR4 (例如 Anti-Human CD56 [NCAM] Antibody, Clone HCD56, ; 或Anti-Human CD184 [CXCR4] Antibody, Clone 12G5, )
• 内胚层: SOX17结合CXCR4, clone 12G5, 货号 #60089 或 FOXA2

收集单细胞以进行流式细胞术分析：

以下是从24孔板的一个孔中收集细胞的实验步骤。如果使用其他培养板，可相应调整试剂用量。

1. 预热ACCUTASE™至室温（15 - 25°C）。
2. 加入1-2 mL的流式缓冲液（PBS+ 2% FBS）至收集细胞的试管中。
3. 移除培养孔中的培养基。使用1 mL 无钙镁离子的D-PBS清洗细胞，移除清洗液。
4. 每孔加入0.5 mL ACCUTASE™。37°C孵育8 - 10分钟。
5. 使用1 mL移液管收集细胞，在培养板中上下吹打打散细胞团块以得到单细胞。
6. 将单细胞悬液移至含有流式缓冲液的试管中。用额外的0.5 mL流式缓冲液润洗培养板后一并移入试管。
7. 300 x g离心5分钟。
8. 弃去上清。加入新的流式缓冲液以重悬细胞。
9. 使用台盼蓝和细胞计数板计算活细胞数量。单细胞悬液可用于流式细胞分析。

流式细胞术标记步骤

1. 预热足量的4%多聚甲醛（PFA），皂苷缓冲液（1 mg/mL皂素溶解于PBS + 1% BSA），和流式缓冲液（PBS + 2% FBS）至室温（15 - 25°C）。
2. 300 x g离心5分钟，弃上清。
3. 使用1 mL的4%多聚甲醛溶液重悬细胞，室温（15 - 25°C）孵育15分钟。
4. 加入2 - 3 mL流式缓冲液至试管中。300 x g离心5分钟，弃上清。
5. 加入新的流式缓冲液，重悬细胞到适当的密度；细胞已被固定，可以进行标记。
6. 请注意：固定好的细胞在标记前可以在2 - 8°C存放最多4天。
7. 每个样本在5 mL流式管中分装大约3 x 10^5个细胞。
   请注意：仅需要进行细胞内抗原标记的样本（例如外胚层）另行放置于冰上或2 - 8°C。跳至第12步进行标记。
8. 对于需要细胞表面抗原标记的样本，300 x g离心固定好的细胞。
9. 离心过程中，准备标记细胞表面抗原（CXCR4或NCAM）和相应对照的抗体溶液 （稀释于流式缓冲液），每个样本需要100 µL。
10. 弃上清，重悬细胞于第9步制备好的100 µL抗体溶液。
11. 室温（15 - 25°C）避光孵育样本30-60分钟。
12. 每个标记样本加入1 mL流式缓冲液。
13. 离心所有的样本（标记好的样本以及第6步中留出的样本），300 x g， 5分钟。弃上清。
14. 每个样本加入1 mL皂苷缓冲液。室温（15 - 25°C）孵育15分钟使细胞透化。
15. 300 x g离心5分钟。
16. 离心过程中，准备细胞内抗原（PAX6 + Nestin、 T、SOX17）和相应对照的抗体溶液 （稀释于皂苷缓冲液）。每个样本需要100 µL。
17. 弃上清。重悬细胞于第16步中准备好的100 µL抗体溶液。
18. 室温（15 - 25°C）避光孵育样本30-60分钟。
19. 每个样本加入1 mL皂苷缓冲液。
20. 离心所有的样本，300 x g，5分钟。弃上清。
21. 在流式缓冲液中重悬样本，用于流式检测。

如有更多问题，请联系技术支持部门info.cn@stemcell.com。