简介

3D培养基

传统2D细胞培养方式受限于培养皿的表面积从而很难实现放大培养，而对剪切力敏感的人多能干细胞由于更依赖贴壁培养的方式，通常又不太能适应大型生物反应器搅拌桨带来的剪切力。3D悬浮培养能够放大人多能干细胞（hPSC）的生产规模，适用于需要大量 hPSC的应用，如高通量筛选、生成主细胞库或工作细胞库以及细胞治疗研究。STEMCELL开发了一系列基于TeSR™ 3D的培养基产品，无需使用微载体或外部基质，搭配PBS-MINI生物反应器，实现将hPSC作为聚集体进行“稳定可持续”的悬浮培养。该产品组合包括：mTeSR™3D（产品号 #03950）、TeSR™-E8™3D（产品号 #03990）和TeSR™-AOF 3D（产品号 #100-0720）。本文为您介绍基于TeSR™ 3D的培养基组合实现 hPSC 聚集体稳健放大的五个步骤：培养基准备、悬浮培养、细胞计数、聚集体传代和日常培养。

培养时间表-分批补料策略

在hPSC培养和传代过程中，按照我们的分批补料策略您可以选择3天/4天的交替时间表进行细胞传代，合理安排培养传代周期，可以避免在周末进行换液传代实验，同时为了快速放大培养，您可以在培养第4天进行传代以最大限度地提高细胞产量；在非传代时间内，您可以选择补料的方式即直接向培养物添加试剂盒中的添加物，或者在第培养3天（第4天需传代）进行半换液培养（参见下文日常培养部分）。

培养器皿及仪器

对于 2 mL 培养物，我们建议在轨道摇床上使用未经 TC 处理的 6 孔板（目录号 #38040），转速设置为 70 rpm。对于 10 mL - 60 mL 的培养体积，建议使用 Nalgene™ Rapid-Flow™ 无菌过滤储存瓶 (ThermoFisher 455-0250)。有关培养物体积和相应的搅拌速率，请参阅表 1。

表 1. Nalgene 过滤存储瓶的培养体积和搅拌速率

对于80 mL-100 mL的体积，建议使用 PBS-MINI 0.1 MAG 一次性容器（产品目录号 #100-1006），并将PBS-MINI 生物反应器基础装置（产品目录号 #100-1005）设置为35- 40 rpm 。对于 300 mL-500 mL的体积，建议使用 PBS-MINI 0.5 MAG 一次性容器（目录号 #100-1007），并将 PBS-MINI 生物反应器转速设置为40-45 rpm。

图 1. 2 mL至500 mL的hPSC培养容器展示

STEMCELL 的 hPSC 3D 培养基针对6孔板中2 mL悬浮培养物的扩增体积进行了优化，在PBS-MINI生物反应器中可培养高达 500 mL的培养物。

培养条件为37°C、5% CO₂。

材料

• 选择基于 TeSR™ 3D 的介质
  • mTeSR™3D（目录号#03950）
  • TeSR™-E8™3D（目录号#03990）
  • TeSR™-AOF 3D（目录号#100-0720）
• D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）（货号 #37350）
• 未经 TC 处理的 6 孔板（目录号 #38040）
• Nalgene™ Rapid-Flow™ 无菌过滤器储存瓶 (ThermoFisher 455-0250)
• 温和的细胞解离试剂（货号#100-0485）
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• 37 µm 可逆过滤器（≤2 mL 培养基）（货号#27215）
• 37 µm 可逆过滤器（>2 mL 培养基）（货号#27250）
• Y-27632（目录号#72304/72308）
• PBS-MINI 生物反应器基本单元（货号#100-1005）
• PBS-MINI 0.1 MAG 一次性容器（目录号#100-1006）
• PBS-MINI 0.5 MAG 一次性容器（目录号#100-1007）
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方案

A. 培养基准备

1. 在室温 (15 - 25°C) 下解冻接种添加物或在2 - 8°C下解冻过夜。（请勿在37°C水浴中解冻）
2. 将接种添加物添加到相应的接种基础培养基中。充分混合
3. 在室温 (15 - 25°C) 下解冻补充添加物或在2 - 8°C下解冻过夜。（请勿在37°C水浴中解冻）
4. 对于mTeSR™3D，需将补充添加物A和补充添加物B结合起来使用

B. 悬浮培养

1. 在室温 (15 - 25°C) 下解冻接种培养基，使用前添加10 µM Y-27632 并充分混合。（请勿在37°C水浴中解冻）
2. 使用显微镜识别分化区域并做标记
3. 使用移液器尖端刮擦或抽吸去除分化区域，避免将培养板从培养箱中取出一次超过15分钟
4. 去除孔中旧的培养基，并在室温 (15 - 25°C) 下添加 1 mL 的 D-PBS
5. 从孔中吸出 D-PBS，并在室温 (15 - 25°C) 下添加 1 mL GCDR
6. 在室温 (15 - 25°C) 下孵育 6 分钟
7. 吸出GCDR。添加1 mL的接种培养基和10 µM Y-27632。用玻璃移液管或细胞刮刀轻轻刮擦菌落，避免将菌落刮成太小的团块
8. 将分离的细胞团转移至15 mL离心管中
9. 小心地上下吹打细胞团块悬浮液
10. 等分细胞团块悬液后进行计数

表2. 细胞接种密度

C. 细胞计数

*一旦聚集体以直径 50-100 µm 的团块传代，就可以进行细胞计数（以ChemoMetec NucleoCounter® NC-250™细胞计数仪为例）

1. 在微量离心管中，加入99 µL A100 溶液、1 µL DAPI 和 100 µL 细胞悬浮液，准备裂解样品
2. 将裂解的样品研磨约 20 次
3. 将 100 µL B 溶液添加到裂解的样品中
4. 将裂解的样品研磨约 20 次。
5. 准备一个新的微量离心管中，将 99.5 µL 细胞悬浮液与 0.5 µL DAPI 混合
6. 使用 Nucleocounter A-2 载玻片，在室 1 中加入30 µL 裂解样品，在室 2 中加入30 µL 原始样本
7. 利用ChemoMetec NucleoCounter® NC-250™ 测定计数

D. 聚集体传代

*悬浮液中的聚集体在传代过程中直径会增长，一般3 - 4 天需解离并重新接种。将聚集体解离成小团块而非单个细胞。（以2 mL初始培养体积中解离聚集体为例）

1. 每孔加入1 mL GCDR，加热至 37°C
2. 在室温 (15 - 25°C) 下解冻接种培养基，使用前添加10 µM Y-27632 并充分混合，每孔3.5 mL
3. 在传代之前评估聚集体大小
4. 将孔径37 µm可逆过滤器放置15 mL离心管口，用2 mL移液管将全部培养物通过过滤器转移至15 mL离心管中，从而滤除非聚集的单细胞
5. 将过滤器放置到新的15 mL离心管上，并用1 mL GCDR（温热 ）冲洗，轻轻敲击过滤器，将所有聚集物移入新管中。对所有聚集体重复此操作。
6. 冲洗掉过滤器上的聚集体后将过滤器放置到第三个15 mL离心管上，确保接触聚集体的过滤器一侧朝上，待步骤12中将聚集体解离成小团块时使用。对所有聚集体重复此操作。
7. 将含有聚集体和 GCDR 的离心管在 37°C 水浴中孵育6分钟，使聚集体沉降。此时GCDR会部分解离聚集体，为生成小团块做准备。
   *最佳孵育时间可能因细胞系而异。
8. 轻轻地从水浴中取出离心管，避免晃动细胞沉淀物。
9. 使用p1000移液器缓慢吸出GCDR，避免吸到聚集物。所有聚集体重复此操作。
10. 将1 mL含有10µM Y-27632 的接种培养基添加到管中。所有聚集体重复此操作。
11. 使用5 mL移液管从管中取出重新悬浮以及部分解离的聚集体。请保持操作在较短时间内完成，以防止聚集物沉降到移液器底部。
12. 使用步骤6中的过滤器将含有聚集体的移液器以垂直方向过滤到新的离心管中。过滤流速设置为0.5 mL/秒，使部分解离的聚集产生适当大小的团块，便于后续传代。所有聚集体重复此操作。
13. 添加0.5 mL含有10 µM Y-27632接种培养基冲洗过滤器中残留的细胞团块。所有聚集体重复此操作。
14. 轻轻弹动管壁以重新悬浮细胞团块。取出适量样品计数活细胞或细胞团。
15. 在室温 (15 - 25°C) 下，将浓缩的细胞团块悬浮液添加到含有10 µM Y-27632的接种培养基的6孔板中。

E. 日常培养

开始hPSC悬浮培养后可按3天/4天交替的时间表传代悬浮培养物（参考上文培养时间表-分批补料策略部分）。

图 3. STEMCELL悬浮培养基及其补料方案

半换液培养

如果在第4天传代，请在第3天使用不含Y-27632的接种培养基进行50%培养基更换，且当日无需添加接种添加物。

在室温（15 - 25°C）下解冻接种培养基（不含 Y-27632）。（请勿在37°C水浴中解冻）

1. 将细胞培养容器转移至无菌环境，建议将6孔板或培养皿倾斜45°，使聚集体自然沉降至培养器皿底部边缘。如果聚集体未沉降则吸去50%的培养物液体后利用过滤器获取聚集体。
2. 将过滤器翻放置在原始培养容器上，添加与去除的培养基体积相同的新鲜接种培养基（不含 Y-27632），确保将聚集体从过滤器中冲洗至培养容器中。