ALDH^br检测是一种基于流式细胞术的检测方法，用于检测活的、表达高水平乙醛脱氢酶（ALDH）活性（称为ALDH“明亮”或ALDH^br）的人脐带血细胞，且细胞表面表达CD45和CD34标志物。ALDH^br检测的有效性取决于其染色结果、数据采集和分析方法的可重复性。

为准确补偿荧光信号并设置合适设门来计算CD45⁺活细胞群中的ALDH^brCD34⁺细胞的百分比，需要制备合适的阴性、单色和荧光扣除对照（FMO）。

样品及其对照的制备

制备用于ALDH^br检测分析的细胞包括2个阶段。第一阶段是测量每个细胞中ALDH活性的酶促反应。被检测的细胞与经活化的ALDEFLUOR™试剂一并孵育、其中，BODIPY™氨基乙醛（BAAA）被ALDH的酶活性转化为带负电荷BODIPY™氨基乙酸酯（BAA），滞留在细胞内。至于阴性对照，另一个细胞样品与BAAA一起被孵育在含有ALDH抑制剂二乙氨基苯甲醛（DEAB）的试剂中。

在第二阶段，用抗CD45、CD34和血型糖蛋白A/B（GlyAB）的抗体对测试和对照细胞样品进行染色。同时，也要准备好补偿和FMO对照管。表1展示了测试和阴性对照样品（含有DEAB）的染色方案。每个测试样品需要重复该染色步骤（包括阴性对照的制备）。表2显示了补偿和FMO对照样品的染色方案。每次实验应至少对一个样品进行补偿和FMO对照染色和分析。有关样品制备和试剂的更多详细信息，请参见ALDH^br Assay Kit产品页面。

设门和数据分析

绘制一个侧向角散射（SSC）和前向角散射（FSC）的密度点图。使用DEAB对照；调整FSC和 SSC电压和增益，使有核细胞群置于SSC与FSC密度图的中间位置。

注意事项：由于目标细胞群是SSC^lo，避免使用SSC阈值。在密度点图上绘制一个大区域，包含有核细胞群。

1. 绘制以下补偿对照样品的二维密度点图
   1. SSC与7-AAD/PE-Cyanine5 GlyAB
   2. SSC与PE CD45
   3. SSC与BAA
   4. SSC与APC CD34
2. 使用单色对照样品设置不同荧光通道之间的溢出补偿。根据流式细胞仪的类型和使用的软件，可以在数据采集之前或之后设置补偿。
3. 补偿调整后，为每个测试样品绘制以下二维密度点图：
   1. SSC与FSC
   2. SSC与7-AAD/PE-Cyanine5 GlyAB
   3. SSC与PE CD45
   4. SSC与BAA
   5. APC CD34与PE CD45
4. 然后依次绘制五个设门，来鉴别7-AAD^-GlyAB^-CD34⁺CD45⁺ALDH^br细胞亚群中活的、有核（7-AAD^-GlyAB^-）细胞、CD45⁺细胞、低SSC的ALDH^br细胞和CD34⁺细胞。设门边界取决于FMO设门对照。图1显示的是确定此细胞亚群百分比的经典的设门策略。

注意事项：强烈建议在染色前从脐带血样品中去除红细胞，因为这样可以在设门时提高分析的准确性，从而实现更快速的数据收集并生成较小的文件。

有关我们ALDH^br Assay Kit或使用和分析此检测方法的更多信息，请浏览我们的技术公告：“使用流式细胞仪检测脐带血中HSPC的ALDH^br检测试剂盒” 或联系techsupport@stemcell.com.

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